人参皂甙Rb1对单侧输尿管梗阻大鼠肾

人参皂甙Rb1对单侧输尿管梗阻大鼠肾 󰀁196󰀁西部医学2009年2月第21卷第2期󰀁MedJWestChina,February2009,Vol.21,No.2 人参皂甙Rb1对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏的 抗氧化保护作用 邓󰀁尧,谢席胜,樊均明,李会娟,肖󰀁敏 (四川大学华西医院肾内科,四川成都610041) 󰀁󰀁󰀁摘要󰀁󰀁目的󰀁观察人参皂甙Rb1对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠氧化应激和肾间质纤维化的影响。方法󰀁将雄性SD大鼠60只随机分为UUO组、Rb1治疗组、假手术(SOR)组,科素亚(ARB)组。每组15只,术后3、7、14d每组随机选择5只大鼠处死。比色法检测肾脏组织匀浆OH󰀁、MDA、SOD,行HE和Masson染色动态观察肾脏病理学改变。结果󰀁与SOR组相比,UUO组大鼠术后3、7、14d,OH󰀁、MDA高于SOR组,SOD低于SOR组。Rb1治疗组大鼠OH󰀁、MDA水平均不同程度低于UUO组,SOD水平均不同程度高于UUO组;其疗效与ARB组相似。与UUO组相比,Rb1能显著减少UUO大鼠胶原在肾间质的沉积,改善肾脏病理损害。相关分析显示,OH󰀁、MDA的达与间质相对面积呈正相关,SOD的表达与间质相对面积呈负相关。结论󰀁人参皂甙Rb1能抗肾间质纤维化;其机制与其抗氧化应激有关。 󰀁关键词󰀁󰀁人参皂甙Rb1;󰀁单侧输尿管梗阻;󰀁氧化应激;󰀁羟自由基;󰀁丙二醛;󰀁超氧化物歧化酶󰀁中图分类号󰀁󰀁R691󰀁2󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文献标识码󰀁󰀁A󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁文章编号󰀁󰀁1672-3511(2009)02-0196-04 AntioxidativeeffectsofGinsenosideRb1onratkidney withunilateralureteralobstruction DENGYao,XIEXisheng,FANJunming,etal (DepartmentofNephrolog,WestChinaHospital,SiChuangUniversity,Chengdu610041) 󰀁󰀁󰀁Abstract󰀁󰀁Objective󰀁ToinvestigatetheantioxidativeeffectofginsenosideRb1onkidneyofratswithunilateralu-reteralobstruction(UUO).Methods󰀁60SDmaleRatswererandomlyassignedintounilateralureteralobstructionmodelgroup(UUO),ginsenosideRb1group(Rb1),sham-operatedgroup(SOR),andARB-treatedgroup(ARB).At3,7,14daysafterUUO,5ratsselectedrandomlyfromeachgroupwerekilled.Hydroxyradical(OH󰀁),ma1ondia1dehvde(MDA),andsuperoxidedinmutase(SOD)inthehomogenizedlysateofobstructiverenalcortexweredeterminedwithhughescolorimetry.RenalpathologychangewasobserveddynamicallywithHEandMassonstaining.Results󰀁ComparedwiththeSORgroupatday3,7,14day,thelevelsofOH󰀁andMDAwereincreasedobviouslyintheUUOgroup(P<0󰀁05).InverselythelevelofSODwasobviouslydecreased(P<0󰀁05).ThelevelsofOH󰀁.andMDAwerelowwerintheRb1treatmentgroupthanUUOgroup(P<0.05),InverselythelevelofSODwashigherthanit.Theeffectwassim-ilarinARB-treatedgroupandRb1treatmentgroup.ComparedwiththeUUOgroup,Rb1decreasedobviouslydepositionofratrenalcollagenwithunilateralureteralobstruction,andimprovedrenalpathologydamage(P<0.05).TheexpressionlevelsofOH󰀁andMDAwerecorrelatedpositivelywithinterstitialoppositearea,theexpressionlevelsofSODwascor-relatednegativelywithit.Conclusion󰀁GinsenosideRb1cancounteractrenalintemtitialfibrosis,andthemechanismisconcernedwithopposingoxidativestress. 󰀁Keys󰀁󰀁 ginsenosideRb1;󰀁 unilateralureteralobstruction;󰀁oxidativestress;󰀁 hydroxyradicalv;󰀁 ma1ondia1dehvde;󰀁superoxidedinmutashydroxy 󰀁󰀁单侧输尿管梗阻(Unilateralureteralobstruc-tion,UUO)是一种急性机械性损伤,可以在较短时间内引起肾间质中成纤维细胞的弥漫增殖,造成间质纤维化。已有研究表明,氧化应激参与了肾间质纤维化的发生发展,抗氧化氧化应激治疗能有效减轻肾间质 纤维化。人参皂甙Rb1是三七总皂甙的主要单体 成分,具有抗氧化应激,抗感染,抗肿瘤,增强免疫力,抗疲劳等作用[2]。研究显示,Rb1能保护心、肺、脑和肾缺血-再灌注损伤[3~6]。但人参皂甙Rb1对UUO动物模型中氧化应激和纤维化的作用目前国内外均 [1] 西部医学2009年2月第21卷第2期󰀁MedJWestChina,February2009,Vol.21,No.2󰀁197󰀁 无报道。我们以UUO动物模型为实验对象,探讨人参皂甙Rb1对(UUO)大鼠氧化应激和肾间质纤维化的影响,为临床防治肾小管间质病变寻求新的方法。1󰀁和方法 1.1󰀁动物和试剂󰀁清洁级雄性SD大鼠,6~8周龄60只,体重(180󰀁20)g。由四川大学华西实验动物中心提供。所有大鼠按清洁级动物分笼喂养,饮用洁净水,饲养环境为每笼5只,大鼠自由饮水,进食,湿度(23󰀁2)󰀁,相对湿度为(55󰀁2)%。羟自由基(OH󰀁)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测试剂盒及蛋白定量试剂盒(双缩脲法)购自南京建成生物公司。人参皂甙Rb1为白色晶体,可溶于水,纯度>98󰀁0%,购自云南植物药业有限公司。 1.2󰀁实验模型制作5%水合氯醛(6ml/kg),腹腔注射麻醉后将大鼠右侧卧位固定于手术台上,剪毛后用75%酒精消毒手术区,行左侧腹切口,逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层,暴露并分离左侧输尿管,假手术组仅切开腹腔并游离左侧输尿管,但不结扎和剪断[7]。手术组依次切开皮肤至腹腔,游离肾脏及输尿管,将左侧输尿管用组织钳托起中段部位,止血钳夹住,在两端用4-0丝线两次结扎左侧输尿管近肾盂段,剪断输尿管,然后连续缝合皮肤,制成单侧输尿管急性完全性梗阻(UUO)动物模型。 1.3󰀁分组及给药方法󰀁按随机数字表法将实验动物分为四组:SOR组、Rb1组、UUO组、ARB组。每组15只。在造模成功后第2天,Rb1组予人参皂甙Rb1溶液腹腔注射50mg/kg󰀁d(按照10mg󰀁1ml配制),其余三组予以同等体积生理盐水腹腔注射。ARB组予氯沙坦溶液灌胃20mg/kg󰀁d,其余三组予以同等体积生理盐水,连续14天。 1.4󰀁肾组织病理󰀁肾组织置4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片、染色。常规4󰀁m切片,进行HE和MASSON染色。 1.4.1󰀁HE染色评估肾小管间质损伤程度󰀁HE染色按照常规方法。参照文献[8],在光镜下随机选择HE染色组织切片中10个不含肾小球的连续不重复视野(󰀁200倍),对肾小管间质病变进行半定量评分。1.4.2󰀁Masson染色评估肾间质相对面积󰀁Masson染色操作按照常规方法。参考文献方法[9],取Mas-son染色组织切片,400倍视野下,拍摄10张连续不重叠的肾皮质视野,用Photoshop7󰀁0软件将20󰀁20网格叠加在每张照片上。计算的肾间质包括覆盖肾小管基底膜及肾间质的小格,但不包括覆盖肾小囊和肾小管旁毛细血管的小格及覆盖肾小球和大血管的小格。肾间质相对面积为肾间质占总体计算小格的百 分数。 1.5󰀁大鼠左肾皮质匀浆OH󰀁、MDA、SOD测定󰀁应用考马斯亮蓝法测定匀浆液蛋白质浓度,依照南京建成生物公司试剂盒提供的方法操作,测定大鼠左肾皮质匀浆液OH󰀁、MDA、SOD含量。大鼠基础指标观察,每组大鼠一般情况可。各组大鼠血清、尿液生化指标正常,组间差异无显著。 1.6󰀁统计学方法󰀁数据用x󰀁󰀁s表示,采用SPSS11󰀁5统计分析软件。组间差异采用单因素方差分析,组间两两比较用SNK检验法。肾间质纤维化程度与肾组织中OH󰀁、MDA、SOD关系采用Pearson相关分析。以󰀁=0󰀁05为检验水准。2󰀁结果 2.1󰀁肾脏病理改变󰀁UUO术后3d远端小管扩张,上皮细胞轻度浊肿、空泡变性,肾间质轻度水肿,间质内有散在淋巴细胞、巨噬细胞浸润;Masson染色可见皮髓交界处出现轻微纤维化。术后7d,近端小管出现扩张,小管上皮细胞浊肿、空泡变性加重,肾间质水肿、炎细胞浸润进行性加重伴有纤维细胞增生;Mas-son染色见皮髓交界处纤维化。术后14d,肾小管结构遭到严重破坏,可见管腔塌陷,上皮细胞大量坏死,肾间质弥漫性巨噬细胞、淋巴细胞浸润和成纤维细胞增生及胶原形成;Masson染色见皮质区、皮髓交界处纤维化明显。见图1、2。 2.2󰀁肾间质相对面积󰀁从表1看,3d时肾间质相对面积,UUO组大于SOR组(q=4󰀁45,P<0󰀁01),其余三组相近(q为0󰀁28~2󰀁88,均P>0󰀁05);7d、14d时肾间质相对面积,仅Rb1组与ARB组均相近(q为0󰀁30、0󰀁51,均P>0󰀁05),其余任意两组比较均不同(q为3󰀁73~10󰀁74,P<0󰀁05或P<0󰀁01)。 表1󰀁肾间质相对面积(󰀁10-2)Tab.1󰀁Therenalinterstitialoppositearea 组别SOR组UUO组Rb1组ARB组 3d6.34󰀁1.5912.58󰀁4.3210.37󰀁3.759.98󰀁2.97 7d6.29󰀁1.7820.54󰀁8.7815.31󰀁4.7614.89󰀁4.81 14d6.78󰀁1.3934.67󰀁9.8821.33󰀁6.7920.61󰀁6.12 2.3󰀁左肾组织匀浆OH󰀁、MDA、SOD含量测定󰀁从表2看,3d、7d、14d的肾组织匀浆OH󰀁含量,除Rb1组与ARB组均相近(q为1󰀁45~2󰀁00,均P>0󰀁05),以及14d时SOR组与ARB组相近(q=3󰀁44,P>0󰀁05)外,其余任意两组比较均不同(q为4󰀁89~35󰀁73,均P<0󰀁01)。从表3看,3d、7d、14d的肾组织匀浆MDA含量,除Rb1组与ARB组均相近(q为0󰀁05~0󰀁31,均P>0󰀁05),以及14d时SOR组与Rb1 󰀁198󰀁西部医学2009年2月第21卷第2期󰀁MedJWestChina,February2009,Vol.21,No.2 表2󰀁肾组织匀浆OH󰀁含量的测定(U/mg) Tab.2󰀁ThedeterminationofOH󰀁contentsinrenaltissuehomogenate 组别SOR组UUO组Rb1组ARB组 3d4.78󰀁0.7936.54󰀁7.1916.57󰀁3.3414.88󰀁3.21 7d4.89󰀁0.9831.45󰀁6.3412.32󰀁2.1410.54󰀁2.89 14d4.51󰀁1.1215.73󰀁2.738.86󰀁1.897.57󰀁1.43 组、ARB组均相近外(q为2󰀁67、2󰀁36,均P>0󰀁05),其余任意两组比较均不同(q为4󰀁44~55󰀁21,均P<0󰀁01)。从表4看,3d、7d、14d的肾组织匀浆SOD含量,除Rb1组与ARB组均相近(q为2󰀁06~4󰀁36,P<0󰀁05或P>0󰀁05),以及3d时SOR组与ARB组、7d时SOR组与ARB组相近(q为2󰀁17、2󰀁48,均P>0󰀁05)外。其余任意两组比较均不同(q为4󰀁65~20󰀁50,均P<0󰀁01)。 2.4󰀁相关分析󰀁对肾间质纤维化程度与肾组织中OH󰀁、MDA、SOD等氧化应激因素进行相关分析。经Pearson相关分析显示肾组织中OH󰀁和MDA含量与Masson染色中胶原沉积成正相关(r=0󰀁954,P<0󰀁01;r=0󰀁977,P<0󰀁01);肾组织中SOD含量与Masson染色中胶原沉积成负相关(r=-0󰀁963;P<0󰀁01)。 3󰀁讨论 肾小球硬化和肾间质纤维化是多种临床和实验性肾病进展的共同转归,是肾功能衰竭的主要病理基础。UUO模型是观察肾小管和肾间质纤维化的经典动物模型,成模率高,重复性好,广泛用于肾间质纤维化的实验研究。本研究结果显示,UUO术后3d可发现肾小管扩张,炎症细胞浸润。术后7d即可观察到 󰀁󰀁注:调整󰀁󰀁=0󰀁017 表3󰀁肾组织匀浆MDA含量的测定(nmol/mg) Tab.3󰀁ThedeterminationofMDAcontentsinrenaltissuehomogenate 组别SOR组UUO组Rb1组ARB组 3d2.76󰀁0.3626.13󰀁3.125.57󰀁1.345.55󰀁2.11 7d2.59󰀁0.559.87󰀁2.344.74󰀁0.924.68󰀁1.76 14d2.56󰀁0.875.57󰀁2.033.69󰀁0.793.56󰀁0.96 󰀁󰀁注:调整󰀁󰀁=0󰀁017 表4󰀁肾组织匀浆SOD含量的测定(U/mg) Tab.4󰀁ThedeterminationofSODcontentsinrenaltissuehomogenate 组别SOR组UUO组Rb1组ARB组 3d 96.96󰀁5.4863.53󰀁7.4286.41󰀁6.3492.41󰀁13.79 7d 89.59󰀁7.1552.84󰀁9.4675.23󰀁7.4284.39󰀁7.12 14d 92.64󰀁6.2449.61󰀁7.1159.37󰀁3.6463.69󰀁11.32 󰀁󰀁注:调整󰀁󰀁=0󰀁017 西部医学2009年2月第21卷第2期󰀁MedJWestChina,February2009,Vol.21,No.2󰀁199󰀁 肾间质纤维化的表现如肾间质增宽、胶原沉积增加、肾小管萎缩等。UUO术后14d,上述纤维化的征象更加明显。说明UUO导致了肾间质纤维化的病变。 UUO模型中由于输尿管结扎后肾组织缺血、缺氧,张力应激所致的肾血浆流量的下降,巨噬细胞和肾小管上皮细胞受活化激发的炎症反应等,均能产生大量的反应氧代谢产物(Reactiveoxygenspecies,ROS),包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH󰀁)和过氧化氢(H2O2)等。Moriyama等 [10] sesoxidativestressandfibrosisintheinterstitiumofmousekid-neyswithunilateralureteralobstruction[J].KidneyInternation-al,2001,59(6):2095-2103.[2][3][4] 张均田.人参皂甙Rgl和Rbl药理作用的比较[J].基础医学与临床,2000,20(5):388-390. 刘正湘,刘晓春.人参皂甙1与对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2002,11(4):374.耿󰀁庆,乌󰀁达,谢远财,等.人参皂甙Rb1对肺缺血再灌注损伤细胞凋亡及其调控基因表达的影响[J].中国中西医结合急救杂志,2005,5(3):159-161.[5][6][7] 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(收稿日期:2008-01-30;修回日期:2008-07-30;编辑:陈󰀁彬) ameliorates renal tubulointerstitialfibrosis causedbyunilateralureteralobstruction[J].KidneyInt,1995,47 发现在UUO 模型肾脏中羟自由基(OH󰀁)等氧化产物的指标明显增高;Lin等[11]证实UUO后10d,梗阻肾组织MDA含量增加、MnSOD活性下降;Ricardo等[12]证实UUO肾脏过氧化氢酶mRNA和蛋白水平下降,SOD活性下降。本研究结果表明UUO模型组大鼠术后3、7d,OH󰀁、MDA明显高于假手术组,SOD明显低于假手术组,术后14d该值有所恢复。术后3、7、14d,各治疗组大鼠OH󰀁、MDA水平均不同程度低于UUO组;SOD水平均不同程度高于UUO模型对照组,UUO存在氧化应激。Sunami和Sugiyamai等 [13,14] 采用基因敲除小鼠研究结果亦与本实验结果 相同,说明氧化应激在UUO模型肾小管间质病变中有着重要的作用。本研究相关性分析表明,肾组织中OH󰀁和MDA含量与Masson染色中胶原沉积成正相关;SOD含量与Masson染色中胶原沉积成负相关。因此,本研究再次证实氧化应激在肾小管间质纤维化中的重要地位。本研究发现,UUO大鼠经人参皂甙Rb1治疗后,通过HE染色、Masson染色,可以看出人参皂甙Rb1明显延缓了肾组织的纤维化,其效果和氯沙坦的效果相似;同时Rb1有效地抑制了氧化应激反应,其疗效也和氯沙坦相似。 4󰀁结论 本研究结果表明,人参皂甙Rb1能有效改善UUO大鼠肾纤维化,其作用机制可能与其能抑制氧化应激反应有关。 󰀁参考文献󰀁 [1] MoriyamaT,KawadaN,NagatoyaK,etal.Fluvastatinsuppres- 欢迎订阅 󰀁󰀁2009年󰀁西部医学󰀁杂志