人参皂甙Rb1对马桑内酯致痫大鼠海马

人参皂甙Rb1对马桑内酯致痫大鼠海马 ·1218·ChineseJournalofPathophysiology2011，27（6）：1218－1221 ［文章编号］1000－4718（2011）06－1218－04 人参皂甙Rb1对马桑内酯致痫 * 大鼠海马组织蛋白质组的影响 徐 11 倩，张春来，杨 221烨，张春燕，赵春玲 （泸州医学院1生理教研室；2生物化学教研室，四川泸州646000） ［摘 要］目的：运用双向电泳技术获得可能与马桑内酯（CL）癫痫发作及人参皂甙Rb1（GRb1）神经保护作 用有关的蛋白质成分，探讨海马组织蛋白质在癫痫发生发展过程中的作用和地位以及GRb1对其的影响。：CL致痫组和GRb1+CL致痫组动物海马组织蛋白，ImageMaster2DPlatinum5．0分别提取对照组、双向电泳分离，软件进行差异达蛋白质组，基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS）鉴定蛋白质。结UPF0628蛋果：成功鉴定出6个蛋白质分别是：脑肌酸激酶（braincreatinekinase）、内吞蛋白A1（endophilin－A1）、白C10orf96同源物（UPF0628proteinC10orf96homolog）、细胞色素P－450（cytochromeP－450）、光导素样蛋白（phosducin－likeprotein）及桥整合蛋白3（bridgingintegrator3）。其中前3个蛋白质在GRb1+CL致痫组表达低于CL致痫组，GRb1+CL致痫组和对照组表后3个蛋白质在GRb1+CL致痫组表达低于对照组。结论：CL致痫组、达的蛋白质存在明显差异。鉴定出的6个差异表达的蛋白质可能与GRb1的神经保护作用有关，其中braincrea-endophilin－A1和UPF0628proteinC10orf96homolog可能与CL所致癫痫发作有关。tinekinase、 ［关键词］马桑内酯；癫痫；人参皂甙Rb1；蛋白质组；大鼠［中图分类号］R338；Q593 ［文献标识码］A doi：10．3969/j．issn．1000－4718．2011．06．032 EffectsofginsenosideRb1onproteomefromhippocampusofratswithepilepsyinducedbyCoriarialactone XUQian1，ZHANGChun－lai1，YANGYe2，ZHANGChun－yan2，ZHAOChun－ling1 2 （1DepartmentofPhysiology，DepartmentofBiochemistry，LuzhouMedicalCollege，Luzhou646000，China．E－mail：zh- chlzth@21cn．com） ［ABSTRACT］AIM：ToexplorethemechanismofdevelopmentofCoriarialactone（CL）－inducedepilepsyandtheneuroprotectiveeffectsofginsenosideRb1（GRb1）ontheprocessofepilepsybyidentifyingtheproteinsrelatedtoCLandGRb1inrathippocampuswithtwo－dimensionalelectrophoresis（2－DE）technology．METHODS：TheratmodelofepilepsywasinducedbyCL．Theratsincontrolgroup，CLepilepticgroupandGRb1+CLepilepticgroupweredecapita-tedandthehippocampuswerecollected．Two－dimensionalelectrophoresiswasappliedtoseparatetheproteinsfromeachgroup．Analysisof2－DEmapswasusedtodeterminedifferentialexpressionofproteinsbyImageMaster2DPlatinum5．0，andsomedifferentiallyexpressedproteinspotswerepickedupforfurtheridentificationbymatrix－assistedlasersorptioni-onizationtime－of－flightmassspectrometry（MALDI－TOF－MS）．RESULTS：Sixproteinsweresuccessfullyidentified．Amongthese，theexpressionofbraincreatinekinase，endophilin－A1andUPF0628proteinC10orf96homologwaslowerinGRb1+CLepilepticgroupthanthoseinCLepilepticgroup．TheexpressionofcytochromeP－450，phosducin－likeproteinandbridgingintegrator3proteinwaslowerinGRb1+CLepilepticgroupthanthoseincontrolgroup．CONCLU-SION：Theproteinexpressionprofilesaresignificantlydifferentamongcontrolgroup，CLepilepticgroupandGRb1+CLepilepticgroup．TheidentifiedproteinsmayberelatedtotheneuroprotectiveeffectsofGRb1．Amongthese，braincreatinekinase，endophilin－A1andUPF0628proteinC10orf96homologmayberelatedtoCL－inducedseizures． ［KEYWORDS］Coriarialactone；Epilepsy；GinsenosideRb1；Proteome；Rats癫痫（epilepsy）是多基因介导的遗传易感性和后天性诸 多因素等共同促成的一类复杂的慢性脑部疾病。海马既是 ［收稿日期］2010－09－02［修回日期］2011－02－25 *［基金项目］四川省教育厅资助项目（No．2006C010）；泸州医学院重点资助项目△通讯作者Tel：0830－3359987；E－mail：zhchlzth@21cn．com ·1219· 癫痫好发部位，也是癫痫研究最多的部位 ［1］ 。既往研究显pH梯度等电聚焦，总伏时数约为80000。随后按常规方法进行第二向SDS－PAGE。2．3 数据分析及质谱鉴定 采用银染法对双向电泳后的凝 胶进行染色。采用ImageMaster2DPlatinum5．0分析软件进行蛋白质的差异分析，以GRb1+CL致痫组凝胶作为参考胶在CL致分别与对照组和CL致痫组凝胶进行蛋白斑点匹配，痫组和GRb1+CL致痫组分别选取相对表达量差异达5倍以胶内酶切，进行MALDI－TOF－MS鉴上的蛋白斑点各3个， 定，获得各蛋白斑点的肽指纹图谱。再结合这些蛋白斑点的pI和MW等信息，使用肽指纹图谱匹配软件Mascot检索匹配GenBank数据库进行蛋白斑点的鉴定。3 统计学处理 采用SPSS11．5软件分析。计量资料数据以均数±标准±s）表示。单变量配对资料之间的比较采用配对样本t珋差（x检验。 癫痫发作后引起包括脑神经元凋亡在内的神经元死亡，示， 人和动物癫痫病灶中存在神经元数目减少现象以海马神经元多见。马桑内酯（Coriarialactone，CL）是从抗精神病中草药马桑寄生中提取的有效成分，具有强烈的致痫作用。采用CL建立癫痫模型是研究癫痫的重要手段［2］。人参皂甙Rb1（ginsenosideRb1，GRb1）系从人参中提取的单体，可通过抗抑制一氧化氮合酶活性、减少一氧化氮的过量产生、阻氧化、止细胞外Ca 2+ 内流减轻钙超载；也有报道 ［3］ 提示GRb1具有 拮抗海马神经细胞凋亡的作用。但GRb1对癫痫的治疗国内外尚未见报道。本研究采用蛋白质组学的研究方法，通过双2－DE）、质谱向凝胶电泳（two－dimensionalelectrophoresis， 分析和生物信息学等技术方法，获得大鼠海马组织蛋白质图谱，以寻找与CL癫痫损伤及GRb1神经保护作用有关的蛋白为深入了解癫痫发病机制、发掘早期诊断的标志物以成分， 及有价值的治疗性靶分子奠定基础。 结 法 1 大鼠行为学改变 果 材 1 材料 料和方 对照组大鼠未见痫性发作。CL组痫性发作程度较高，在注射CL后15－20min左右即出现Ⅲ一Ⅳ级发作，持续5－10min，间隔3－5min再次发作，但程度较前次轻，之后发作Rb1+CL组大间隔时间延长，程度逐渐减轻。与CL组相比，鼠的痫性发作程度明显减低，潜伏期变长，持续时间变短（P＜0．01），2。差异显著，见表1、 表1 各组大鼠癫痫发作级别比较 Seizureintensity 0100 Ⅰ001 Ⅱ001 Ⅲ010 Ⅳ030 Ⅴ060 健康成年雄性SD大鼠，体重240－260g，由泸州医学院动物科提供；马桑内酯购自华西医科大学制药厂；人参皂甙Rb1购自成都蓉金医药科技开发有限公司；蛋白定量和双向电泳所用试剂均购自Bio－Rad。主要实验仪器包括：组织匀浆器（北京鼎国公司），Labofuge400R冷冻离心机（Herae-us），ProteanIEF电泳仪（Bio－Rad），ProteanIIMulti－Cell垂直电泳系统（Bio－Rad），凝胶图像扫描仪PowerLook1100（UMAX），4700串联飞行时间质谱仪（ABI）。22．1 方法 模型制备及动物分组 参照柴慧霞等 ［4］ Table1．Comparisonofseizureintensityamongthethreegroups Group 制作的大鼠癫 ［5］痫模型，并参照Diehl等的癫痫分级标准对癫痫发作进行 ControlCLepileptic## ## 分级：0级：无异常行为；I级：须动，咀嚼，跑动；Ⅱ级：头面部抽搐；Ⅲ级：上肢或下肢间断性抽搐；IV级：四肢和躯干持续节律性抽搐；V级：四肢和躯干强直性抽搐或伴有翻滚、跌倒等表现。Ⅲ级及Ⅲ级以下为轻型发作，Ⅳ级及以上为重型发作。 选取雄性成年SD大鼠30只，随机均分为3组：对照组、CL致痫组和GRb1+CL致痫组。GRb1+CL致痫组大鼠用GRb1（30mg/kg）每天灌胃1次，连续3d，第4d腹腔注射CL（4mg/kg），观察其行为学改变。自腹腔注射CL后开始计3h后取材。CL致痫组除实验前3d用等量生理盐水灌时， 胃外，余处理同GRb1+CL致痫组。对照组除第1d腹腔注射等量生理盐水外，余处理同CL致痫组。2．2 样品制备及双向电泳 根据癫痫发作程度、潜伏期及 2 发作持续时间等确定造模成功。每组各取3只大鼠断头处死取脑组织并剥离海马，取海马组织60mg+300mL裂解液冰4℃、12000r/min离心1h，上裂解30min，收集的上清液即为蛋白质提取物。用Bradford法测定各样品的总蛋白含量，－80℃保存备用。采用17cm的线性固定pH梯度分装， （immobilizedpHgradient，IPG）预制干胶条（pH4－7），每根按照Bio－Rad说明进行第一向固相胶条上样量260μg， ＊ 8GRb1+CLepileptic＊ ＊ P＜0．01vscontrolgroup；＊P＜0．01vsCLepilepticgroup． 表2各组大鼠癫痫发作潜伏期和持续时间比较 Table2．Comparisonoflatentperiodanddurationtimeamong thethreegroups（min．x±s．n=10）珋GroupControlCLepileptic ## Latentperiod 016．29±0．37## Duration07．51±0．48## ＊ 2．45±0．39＊ ＊ GRb1+CLepileptic34．35±0．42＊ ＊ P＜0．01vscontrolgroup；＊P＜0．01vsCLepilepticgroup． 蛋白质图谱改变 GRb1+CL致痫组与CL致痫组和对照组相比，蛋白质图 谱发生了明显改变，主要表现为蛋白质斑点数量的增减和灰度值的变化。GRb1+CL致痫组与对照组的差异蛋白斑点有84个，GRb1+CL致痫组与CL致痫组的差异蛋白斑点有120个，这些表达差异的蛋白质斑点绝大部分集中于pH4．2－6．72。的偏酸性区域，相对分子量主要介于16－96kD，见图1、 ·1220· Figure1．2－DEmapsofproteomefromhippocampusofratsineachgroup．A：controlgroup；B：CLepilepticgroup；C：GRb1+CL epilepticgroup． 图1 各组大鼠海马组织蛋白质2－DE 图谱 3 蛋白质鉴定 筛选出的6个差异表达的蛋白质斑点进行MALDI－TOF－MS检测，获得了各蛋白质斑点的肽指纹图谱（图3所示为所检测的第6点的蛋白质肽指纹图谱）。鉴定出的这6个差异表达的蛋白质为脑肌酸激酶（braincreatinekinase）、内吞蛋白A1（endophilin－A1）、UPF0628蛋白C10orf96同源物（UPF0628proteinC10orf96homolog）、细胞色素P－450（cytochromeP－ Figure2．Identifiedproteinspotsbymassspectrometry．A：CL epilepticgroup；B：GRb1+CLepilepticgroup． 图2 质谱鉴定的蛋白点 450）、光导素样蛋白（phosducin－likeprotein）及桥整合蛋白3（bridgingintegrator3），见表3。其中前3个蛋白质在GRb1+CL致痫组表达低于CL致痫组，后3个蛋白质在GRb1+CL致痫组表达低于对照组 。 Figure3．Peptidemassfingerprintingofthenumber6proteinspotfrom2－DEmapsofGRb1+CLgroup．图3 GRb1+CL组2－DE图谱中蛋白斑点6的肽指纹图谱 表3 SpotNo．123456 Gi31542401119588806250910972145070510177577531055 ProteinnameBraincreatinekinaseEndophilin－A1 UPF0628proteinC10orf96homolog CytochromeP450Phosdusin－likeproteinBridgingintegrator3 质谱分析鉴定的蛋白质Matchscore536472338856 MatchpeptideTheo．MW（D） 664356 429704004531075562123427429691 Theo．pI5．335．265．266．794．756．95 Exp．MW（D）522274536234434523422837626840 Exp．pI5．615．205．326．824．776．80 Table3．Identifiedproteinsbymassspectrometry ·1221· 在纤丝状肌动蛋白的定位中有一定作质分裂和分隔有关， 以解聚时的球状肌动蛋白或聚合时的纤丝状肌动蛋白形用， 式存在。正常细胞中肌动蛋白2种形态的转换处于动态平衡，共同行使细胞的变形运动、胞质分裂、基质附着和胞间连接等多项功能要的作用 ［11］ ［10］ 讨论 已鉴定出6个差异表达的蛋白斑点，其中脑肌酸激酶、吞蛋白A1和UPF0628蛋白C10orf96同源物在CL致痫组表达高于GRb1+CL致痫组，由此推测它们可能与CL所致的癫痫发作和海马神经元损伤有关，也可能与GRb1减轻癫痫发作和神经元损伤有关。 脑肌酸激酶，是在脑内催化ATP和肌酸转化为ADP和磷酸肌酸的特殊同工酶，可能在小脑的发育过程中参与ATP的产生过程。有研究表明，脑肌酸激酶活性高低与原发脑实质损伤程度成正比，损伤越重，对脑实质破坏范围越大，脑肌酸激酶活性越高。本实验中CL致痫组脑肌酸激酶表达上调说明可能与CL诱导大鼠癫痫发生后引起的脑损伤有关。同时脑肌酸激酶在GRb1+CL致痫组表达下调说明可能是由于GRb1抑制其活性而产生的神经保护作用。内吞蛋白A1，是一种脂质酵素，属于内吞蛋白家族，含有1个BAR结构域和1个SH3结构域，其功能和磷脂酶A2相反，与突触囊泡的内负责在细胞内外转运物质。UPF0628蛋白吞作用相关， C10orf96同源物属于UPF0628蛋白质家族，其功能尚未阐明。 细胞色素P－450、光导素样蛋白和桥整合蛋白3在GRb1+CL致痫组表达低于对照组，推测可能是GRb1通过抑制这3种蛋白质的表达而发挥神经保护作用。细胞色素P－450是广泛存在于生物体内的一类含血红素和硫羟基的蛋白。细胞色素P－450同工酶是血红蛋白超级家族，参与外 。它们在细胞的形态维持、物质运输、信号 能量转换及细胞的运动和分裂等多个过程中发挥着重转导、 。 本研究中已鉴定的相关蛋白质涉及细胞凋亡、细胞信号转导、物质转运等，提示癫痫发生和发展过程可能涉及相应的病理生理过程。今后将结合细胞信号转导途径从细胞整体生理活动变化的角度分析上述已鉴定的差异表达蛋白质在癫痫发生和发展过程中的生物学意义，以期获得对癫痫发病机制更深刻的理解，发掘出早期诊断的标志物以及有价值的治疗性靶分子。 ［参 考 文 献］ ［1］王胜军，迟兆富，王树华，等．PARP调节癫痫大鼠海马 ．中国病理核转录因子κB及相关炎症因子的表达［J］2010，26（1）：86－90．生理杂志，［2］刘广益，王巧稚，郭 勇，等．急性癫痫大鼠弓状核 HSP70的表达－免疫组织化学研究［J］．泸州医学院学2003，26（3）：193－196．报，［3］王卫霞，王 巍，陈可冀，等．人参皂甙对动物脑神经保 J］．中国中西医结合杂志，护作用及其机理研究进展［2005，25（1）：89－93． 4］柴慧霞，谢扬高，陈启贤，等．马桑内酯制造大鼠癫痫模源性物质的代谢，所产生的代谢产物可能有毒性或致癌性。［ ．四川医学院学报，1983，14（3）：283－型的［J］P－450代谢活性产物造成细胞损伤有2条途径［6］：（1）药物活性代谢产物直接与细胞内大分子如DNA、蛋白质共价结合，破坏细胞内稳态，导致细胞凋亡（坏死）；（2）通过与氧分子作用产生活性氧产物，从而引起细胞突变，脂质过氧化 2+2+ 破坏细胞结构和蛋白，大量Ca内流激活Ca依赖蛋白酶 287． ［5］DiehlGR，SmialowskiA，GotwoT．Developmentandper-sistenceofkindledseizuresafterrepeatedinjectionsofpentylenetetrazolinratsandguineapigs［J］．Epilepsia，1984，25（4）：506－510．．［6］黄［7］ 翀，张欣欣．细胞色素P－450与药物性肝损伤［J］．肝脏，2008，13（3）：252－254． MyasoedovaKN．NewfindingsinstudiesofcytochromesP450［J］．Biochemistry，2008，73（9）：965－969．［8］LukovGL，HuT，McLaughlinJN，etal．Phosducin－like proteinactsasamolecularchaperoneforGproteinβγdi-J］．EMBOJ，2005，24（11）：1965－1975．merassembly［［9］夏 J］．国外医杰，陈阳美．难治性癫痫与信号转导［2004，31（1）：64－67．学：神经病学·神经外科学分册， ［10］BausenM，FuhnnannJC，BetzH，etal．Thestateofthe actincytoskeletondeterminesitsassociationwithgephyrin：roleofena/VASPfamilymembers［J］．MolCellNeuros-ci，2006，31（2）：376－386．［11］邢鸣鸾，朱 欣，王晓峰，等．荧光标记法检测不同毒 ．水生生物学报，2007，31物对细胞骨架的影响［J］（6）：912－914． 和核酸酶，最终导致细胞死亡。俄罗斯医学科学院Myasoe-dova认为［7］，在一定条件下细胞色素P－450能够产生活性氧，最近在线粒体中也发现微粒体细胞色素P－450的类似物，推测它能导致线粒体功能紊乱、细胞凋亡，还可能参与了一些疾病的发生。细胞色素P－450在GRb1+CL致痫组表达下调，说明GRb1可能通过抑制细胞色素P－450的表达而起到抗细胞凋亡的作用。光导素样蛋白，通常以βγ复合物是一种GTP结合蛋白，为信号转导蛋白。有研的形式存在，究认为 ［8］ ，光导素样蛋白作为分子伴侣参与G蛋白βγ二聚 体的装配过程，其缺失可抑制G蛋白βγ二聚体的形成，影响G蛋白信号转导系统的信号传递过程。信号转导在难治性癫痫的发病机制中起着重要作用 ［9］ ，胞外信号脑源性神经 G蛋白耦生长因子、神经递质通过跨膜结构酪氨酸受体激酶、联受体；神经细胞黏附分子介导的细胞直接接触都可激活胞蛋白激酶C，通过调节内蛋白激酶，如丝裂素活化蛋白激酶、 神经元生长、分化、凋亡和诱导神经元重组等方式参与难治性癫痫的发病。桥整合蛋白3，包含1个BAR结构域，与胞