人参皂甙Rb1_黄芪抗大鼠大脑皮层神

人参皂甙Rb1_黄芪抗大鼠大脑皮层神 󰀁24󰀁 江西医学院学报2006年第46卷第4期󰀁ActaAcademiaeMedicinaeJiangxi2006,Vol46,No4 人参皂甙Rb1、黄芪抗大鼠大脑皮层 神经细胞缺氧性凋亡研究 唐󰀁宁1,文󰀁珠2,张󰀁进3,聂荣庆3,胡国柱3 (1.深圳市西丽人民医院呼吸内科,广东深圳518055;2.江西省医学科学研究所血液研究室,南昌330006; 3.江西省中医药研究院免疫室,南昌330077) 黄芪对体外培养的新生大鼠大脑皮层神经细胞缺氧性凋亡的保护机理。方法󰀁摘要:目的󰀁研究人参皂甙Rb1、 应用Neurobasal加B27Supplement体外培养大鼠大脑皮层神经细胞;流式细胞仪检测神经细胞凋亡率;Hoechst33342荧光染色法检测神经细胞凋亡率。结果󰀁(1)流式细胞仪测定结果:正常对照组神经细胞凋亡率为0.78%,凋亡阳性组细胞凋亡率为31.61%,人参皂甙Rb11、2、3组细胞凋亡率分别为8.52%、4.86%、1.43%,黄芪注射液1、2、3组细胞凋亡率分别为16.06%、7.03%、1.22%;(2)神经细胞凋亡阳性组可见有明显的凋亡梯状条带,而正常对照组、人参皂甙Rb12组、黄芪注射液2组未见有明显的凋亡梯状条带;(3)Hoechst33342荧光染色结果:正常对照组神经细胞凋亡率为(8.24󰀁0.31)%,凋亡阳性组细胞凋亡率为(41.30󰀁2.56)%;与凋亡阳性组比较,缺氧前加BDNF组细胞凋亡率为(21.06󰀁0.72)%(P<0.05),缺氧后加BDNF组细胞凋亡率为(27.82󰀁3.65)%(P<0.01);缺氧前加人参皂甙Rb13组细胞凋亡率为(12.57󰀁1.61)%(P<0.05),缺氧后加人参皂甙Rb14组细胞凋亡率为(23.71󰀁2.24)%(P<0.01);缺氧前加黄芪注射液1、2、3组细胞凋亡率分别为(20.28󰀁1.00)%、(18.67󰀁0.57)%、(13.84󰀁0.79)%(P<0.05),缺氧后加黄芪注射液4组细胞凋亡率为(26.46󰀁2.18)%(P<0.01)。结论󰀁人参皂甙Rb1在100󰀁g/mL,黄芪在10~100mg/mL的浓度范围內,具有抗缺氧的神经细胞凋亡的作用。 关键词:人参皂甙Rb1;黄芪;神经细胞;缺氧;细胞凋亡;大鼠 中图分类号:Q255;R364.4󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁文章编号:1000-2294(2006)04-0024-04 StudyofTheInfluenceofGinsenosideRb1andHuangqionThe ApoptosisofPrimaryCulturedNeonateRatCerebralCortical NeuronsCausedbyHypoxiainVitro TANGNing1,WENZhu2,ZHANGJin3,NIERong-qing3,HUGuo-zhu3 (1.DepartmentofRespirationMedicine,ShenzhenXiliPeople󰀁sHospital,Shenzhen518055,China;2.DepartmentofHematology,JiangxiProvinceInstituteofMedicalSciences,Nanchang330006,China;3.DepartmentofImmunology,JiangxiProvinceAcademy ofChineseMedicineandPharmacology,Nanchang330077,Chian) ABSTRACT:Objective󰀁ToinvestigatetheprotectivemechanismofGinsenosideRb1andhuangqiontheapoptosisofprimaryculturedcerebralcorticalneuronscausedbyhypoxia.Methods󰀁Thecerebralneuronsofpostnatalratswereprimaryculturedinfree-serumwithneurobasalmediumsuppliedwith2%B27supplement.FACSassay,DNAagarosegelelectrophoresis,hypoxiccu-ltureofneurons,andHoechst33342stainingwereconducted.Results󰀁InFACSassaytheapop-toticrateofthenormalcontrolgroupandofthehypoxia-inducedapoptoticgroupwere0.78%and31.61%respectively.TheapoptoticrateoftheginsenosideRb1experimentalgroups1,2,and3 收稿日期:2006-06-26 作者简介:唐宁(1957-),女,副主任医师,本科,主要从事呼吸系统疾病的诊治研究。 江西医学院学报2006年第46卷第4期󰀁ActaAcademiaeMedicinaeJiangxi2006,Vol46,No4 󰀁25󰀁 were8.52%,4.86%,and1.43%,respectively,andtheapoptoticrateofthehuangqiinjectionexperimentalgroups1,2,and3were16.06%,7.03%,and1.22%,respectively.InagarosegelelectrophoresisofDNAthehypoxia-inducedapoptoticgroupshowedaladderoffragments.Theladder,however,washardlyobservedinthenormalcontrolgroup,theginsenosideRb1exper-imentalgroup2andthehuangqiinjectionexperimentalgroup2.Hoechst33342stainingfoundthattheapoptoticratewas(8.24󰀁0.31)%innormalcontrolgroup,(41.30󰀁2.56)%inthein-ducedapoptoticgroupan,(21.06󰀁0.72)%inthegroupofBDNFaddedbeforehypoxia(P<0.05)and(27.82󰀁3.65)%inthegroupofBDNFaddedafterhypoxia(P<0.01),buttheapop-toticrateoftheGinsenosideRb1experimentalgroup3was(12.57󰀁1.61)%(P<0.05)beforehypoxiaaddingGinsenosideRb1andtheapoptoticrateoftheGinsenosideRb1experimentalgroup4was(23.71󰀁2.24)%afterhypoxiaaddingGinsenosideRb1(P<0.01),andtheapop-toticrateofthehuangqiinjectionexperimentalgroupfrom1to3was(20.28󰀁1.00)%,(18.67󰀁0.57)%,(13.84󰀁0.79)%(P<0.05)beforehypoxiaaddinghuangqiinjection,respectivelyandtheapoptoticrateofthehuangqiinjectionexperimentalgroup4was(26.46󰀁2.18)%afterhypoxiaaddinghuangqiinjection(P<0.01).Conclusion󰀁TheGinsenosideRb1andhuangqiareabletopreventprimaryculturedcerebralcorticalneuronsfromtheapoptosisofhypoxicneurons.KEYWORDS:ginsenosideRb1;astragalus;neuroncell;hypoxia;apoptosis;rats󰀁󰀁慢性阻塞性肺病、呼吸功能衰竭、以及肺性脑病,其神经细胞都有缺氧的病理发展过程。彭斌[1]将大鼠置于常压低氧氧舱中建立急性和慢性间断性缺氧动物模型证明,缺氧可诱导神经细胞凋亡。故凋亡在缺氧性脑损伤中起着十分重要的作用。体外研究表明,补阳还五汤喂养的大鼠血清使培养的大鼠脑神经细胞表现出显著地抗缺氧性凋亡作用[2]。人参皂甙Rg1减少了缺氧诱导的胚鼠脑神经元DNA的断裂[3]。本文对人参皂甙Rb1及黄芪进行抗神经细胞缺氧性凋亡的作用机理研究,希望论证是否补气药均有抗神经细胞缺氧性凋亡的作用,从而为临床治疗慢性阻塞性肺病、呼吸功能衰竭及肺性脑病的正确合理用药提供理论依据。 (美国Sigma公司,批号:4977);琼脂糖(上海东海制药厂公司,批号:010103);碘化丙啶(美国Sigma公司,批号:B42234);DNA标记物DL-2000(日本Takara公司);Rnase(BovinePancreas);人参皂甙Rb1标准品(中国药品生物制品检定所);黄芪注射液(黑龙江珍宝岛制药公司,批号:20021112);缺氧罐及氮气、二氧化碳空气混合器(长沙长锦应用技术研究所,CJ.MIX-3型);流式细胞仪(美国BD公司生产,型号:FACSCalibur)。 1.2󰀁方法 1)󰀁体外新生大鼠大脑皮层神经细胞培养及实验分组:(1)新生大鼠大脑皮层神经细胞原代无血清培养:新生大鼠大脑皮层神经细胞原代无血清培养方法见参考文献[4];(2)新生大鼠大脑皮层神经细胞缺氧复氧培养:新生大鼠大脑皮层神经细胞缺氧复氧培养方法见参考文献[4];(3)实验分组:󰀁正常对照组:在37󰀁,5%CO2,饱和湿度培养;󰀁凋亡阳性组:缺氧12h复氧培养48h;󰀁BDNF组:在缺氧前0h及缺氧12h后加入终浓度为50ng/mL的BDNF;󰀁人参皂甙Rb11组、2组、3组:在缺氧培养前0h分别加入终浓度为10、50、100󰀁g/mL的人参皂甙Rb1;4组:缺氧12h后加入50󰀁g/mL的人参皂甙Rb1;󰀁黄芪注射液1组、2组、3组:在缺氧培养前0h分别加入终浓度为10、50、100mg/mL黄芪生药量;4组:缺氧培养12h后加入501󰀁材料与方法 1.1󰀁材料 1)󰀁实验动物:出生24h内的SD大鼠(清洁级)120只,雌雄兼有,体重7~9g。由南昌大学医学院实验动科部提供。 2)󰀁药品、主要试剂与主要仪器:NeurobasalMedium、B27Supplement(美国GIBCOBRL公司,批号:1153623、1027887);马血清(美国Sigma公司,批号:092K8404);优质新生牛血清(杭州四季青生物材料有限公司,批号:0205212);Hoechst33342(美国Sigma公司,批号:021206);D-多聚赖; 󰀁26󰀁 江西医学院学报2006年第46卷第4期󰀁 表1󰀁 ActaAcademiaeMedicinaeJiangxi2006,Vol46,No4人参皂甙Rb1、黄芪干预缺氧诱导神经细胞凋亡的Hoechst33342荧光染色结果(%,󰀁s) 组别 正常对照组(缺氧0h) 神经细胞凋亡率8.24󰀁0.31#41.30󰀁2.5621.06󰀁0.72#27.82󰀁3.65󰀁23.08󰀁2.78󰀁17.73󰀁3.77󰀁12.57󰀁1.61#23.71󰀁2.24󰀁20.28󰀁1.00# 18.67󰀁0.57#26.46󰀁2.18󰀁13.84󰀁0.79# 2)󰀁PI染色流式细胞仪检测:PI染色流式细胞仪检测方法参照文献[5],使用氩离子激发荧光,激发波长为488nm,检测软件为CEUQuest,数据使用MouFitLT软件分析及统计。 3)󰀁DNA琼脂糖凝胶电泳:DNA琼脂糖凝胶电泳方法参照文献[5],于紫外透射仪上观察电泳条带。 4)󰀁神经细胞Hoechst33342荧光染色:神经细胞Hoechst33342荧光染色方法参照文献[4],计数200个细胞,计算凋亡率(%)。1.3󰀁统计学方法 数据以󰀁s表示。采用SPSS统计软件单因素方差分析方法。其中经方差齐性检验后:(1)方差齐的数据则采用LSD方法检验;(2)方差不齐的数据则采用DunnettC方法检验。 凋亡阳性组(缺氧12h复氧48h) BDNF组(缺氧0h)BDNF组(缺氧12h)人参皂甙Rb11组(缺氧0h)人参皂甙Rb12组(缺氧0h)人参皂甙Rb13组(缺氧0h)人参皂甙Rb14组(缺氧12h)黄芪注射液1组(缺氧0h)黄芪注射液2组(缺氧0h)黄芪注射液3组(缺氧0h)黄芪注射液4组(缺氧12h) 󰀁󰀁与凋亡阳性组比较,#P<0.05,󰀁P<0.01,󰀁P>0.05 3󰀁讨论 持续性支气管哮喘、慢性阻塞性肺病、呼吸窘迫综合征等引起通气不足,气体分布不匀导致通气/血流比例失调,弥散性肺纤维化、肺气肿等肺组织病变有效弥漫面积减少,以及急性或慢性呼吸衰竭等疾病都可导致缺氧或二氧化碳潴留引起的一系列中枢神经精神症状和体征,如头疼、头晕、烦燥不安、精神错乱、言语和神志不清、扑翼样震颤、嗜睡、抽搐、昏迷、甚至呼吸抑制等产生肺性脑病。这都将引起中枢神经缺氧性神经细胞凋亡,因此都可以进行抗神经细胞凋亡治疗。 李君庆等 [3] 2󰀁结果 人参皂甙Rb1、黄芪与缺氧的新生大鼠大脑皮层神经细胞凋亡的流式细胞仪检测:培养4d后再缺氧12h复氧培养48h的神经细胞经碘化丙啶(PI)染色,流式细胞仪测定,结果显示正常对照组神经细胞凋亡率0.78%,凋亡阳性组细胞凋亡率31.61%,人参皂甙Rb11组、2组、3组的神经细胞凋亡率分别为8.52%、4.86%、1.43%,黄芪注射液1组、2组、3组的神经细胞凋亡率分别为16.06%、7.03%、1.22%。 人参皂甙Rb1、黄芪与缺氧的新生大鼠大脑皮层神经细胞凋亡的DNA电泳表现:提取培养4d并缺氧12h复氧培养48h的神经细胞DNA,经溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳显示凋亡阳性组在300~500bp处有三条明显的凋亡梯状条带,而正常对照组和人参皂甙Rb12组及黄芪注射液2组未出现明显的凋亡梯状条带。 人参皂甙Rb1、黄芪对缺氧诱导的新生大鼠大脑皮层神经细胞凋亡的Hoechst33342荧光染色影响:培养4d的神经细胞缺氧12h复氧培养48h,各组Hoechst33342荧光染色结果见表1。凋亡阳性组可见细胞核染色质凝集、致密浓染,细胞核染色质固缩或碎裂成2块以上。人参皂甙Rb11组、2组、3组,以及黄芪注射液1组、2组、3组,凋亡细胞随药物的浓度增加而逐渐减少。缺氧培养12h加入人参皂甙Rb1和黄芪注射液组凋亡率比缺氧前加入的高,但比凋亡阳性组低。 使用PI双染流式细胞仪及DNA 琼脂糖凝胶电泳证明人参皂甙Rg1在1~10 󰀁moL/L时,能减少原代胚鼠大脑皮层神经元缺氧诱导的DNA的断裂和细胞凋亡。本文采用神经细胞体外缺氧培养方法也证明缺氧的神经细胞PI染色流式细胞仪测定凋亡亚二倍体峰升高,凋亡率达31.61%,而人参皂甙Rb1和黄芪随浓度的增加凋亡率明显下降(见表1)。DNA琼脂糖凝胶电泳发现人参皂甙Rb1(50󰀁g/mL)及黄芪注射液(50mg/mL)未见明显的凋亡梯状条带。 Hoechst33342染色证明人参皂甙Rg1在1~10󰀁moL/L时能降低缺氧诱导的神经细胞凋亡率从56.7%降至20.4%,对照组为2.2%[3]。而本文Hoechst33342染色也证明人参皂甙Rb1(10~100󰀁g/mL)及黄芪(10~100mg/mL)其凋亡细胞随药物浓度的增加而减少,凋亡率从23.08%降至12.57%,以及从20.28%降至13.84%,而缺氧12h后加入抑制作用虽有减弱,仍显著低于凋亡阳性组 江西医学院学报2006年第46卷第4期󰀁ActaAcademiaeMedicinaeJiangxi2006,Vol46,No4 󰀁27󰀁 从上述结果作者初步认为补气中药可能均有抗神经细胞缺氧性凋亡作用,可以用于慢性阻塞性肺病,持续性支气管哮喘,各种病因引起的急性和慢性呼吸衰竭,以及肺性脑病的治疗。 神经元缺氧凋亡的影响[J].第一军医大学学报,2002,22:35-38. [3]󰀁李君庆,张香阁,张均田.人参皂甙Rg1抗神经细胞凋亡作用 机制的研究[J].药学学报,1997,32(3):406-410. [4]󰀁聂荣庆,李扣华,胡国柱,等.黄芪抗新生大鼠大脑皮层神经 细胞缺氧性凋亡研究[J].中国中医基础医学杂志,2004,10(11):34-37. [5]󰀁姜泊.细胞凋亡基础与临床[M].北京:人民军医出版社,1999: 17-20. 参考文献: [1]󰀁彭斌,李舜伟,潭会兵.慢性间断性缺氧诱导大脑细胞凋亡的 研究[J].北京医学,2002,24(5):339-341. [2]󰀁曲宏达,佟丽,沈剑刚,等.补阳还五汤对体外培养的大鼠皮层 (上接第23页) 胃溃疡14d后,含壳聚糖组与空白对照组、雷尼替丁组和硫糖铝组比较,溃疡面积显著缩小,表明壳聚糖能够促进溃疡的愈合。同时通过胃液分析发现壳聚糖有一定的降低胃酸作用,但对胃蛋白酶无明显影响,说明壳聚糖可能通过增强黏膜的防御功能促进溃疡的愈合。 消化性溃疡近期愈合率高,但易复发,研究显示溃疡的愈合质量(QOUH)的提高可减少溃疡的复发。90年代初,TARNAWSKIA等首先提出了QOUH的概念,认为溃疡愈合不仅需要修复黏膜缺损,更需要修复和重建黏膜下组织结构;评价QOUH不仅要衡量溃疡局部再生黏膜的结构成熟度,而且也应重视其功能的成熟度,并以此判定对未来溃疡复发的影响以及评价药物治疗的疗效。本实验显示,使用含壳聚糖组药物治疗乙酸诱发的大鼠胃溃疡14d后,再生黏膜的厚度与空白对照组和雷尼替丁组比较显著增加,囊状扩张腺体数量减少,腺体层数增加,并且腺体间结缔组织面积减少,腺体面积相对增多,在肉芽组织中微血管数量明显增多,结果与硫糖铝类似。提示壳聚糖能够改善胃溃疡大鼠的再生黏膜结构质量。黏液是由胃上皮细胞和胃腺颈黏液细胞分泌的具有黏滞性的糖蛋白凝胶,覆盖于胃黏膜表面和小凹表面,具有保护黏膜免受腔内氢离子、胃蛋白酶、微生物和毒物等损害的功能,黏液的分泌增加也是评价再生黏膜功能成熟度的一项指标 [8] [7] 本文结果显示,壳聚糖与雷尼替丁或硫糖铝混合用,其抗溃疡及改善溃疡愈合质量的效果较单用雷尼替丁或硫糖铝效果要佳。分析其原因除了两种 药物的作用相加外,可能与壳聚糖有良好的黏膜黏附特性,可延长药物在消化道内的作用时间,提高药物的生物利用度,从而增加药物的效果有关机制有待于进一步的实验研究。 [9] ,具体 [江西省卫生厅资助项目(02229)] 参考文献: [1]󰀁顾其胜.医用几丁聚糖在临床医学中的应用[J].上海生物医学 工程杂志,1998,19(2):38-42. [2]󰀁武雪芬.甲壳质对人体生理生化功能的调节作用[J].河南中 医,1998,18(4):244. 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