隐匿性乙型肝炎病毒感染调查与分析

隐匿性乙型肝炎病毒感染调查与分析 ±堡塞墅塑堕壅丛耋兰壁查垫！！堡！！旦筮型鲞筮！塑垦！垫！竺』兰理璺！垫！！型：望！！！里！！！！！！！：！些箜：壁堡垒 ・４５７・ 病毒病诊断与治疗． 丽水地区无偿献血者中隐匿性乙型肝炎病毒感染调查与分析 纪勇平，赵龙友，周斌，钟美莲，庄杰，袁权 【摘要】 目的 隐匿性乙型肝炎感染一直是困扰献血中健康血清筛查的一个重要因素，通过高 度灵敏的Ｎｅｓｔ—ＰＣＲ检测对献血者中的ＯＢＩ进行调查，了解该地区隐匿性ＨＢＶ感染情况和基因 分析。方法共收集１００８０例献血者血浆，进行进口雅培ＨＢｓＡｇ试剂和北京万泰抗－ＨＢｅ及抗．ＨＢｓ 试剂平行检测，采用高灵敏度的Ｎｅｓｔ・ＰＣＲ进行核酸检测和基因调取。结果 １０ ０８０例无偿献血者 中，共检出雅培（超敏）ＨＢｓＡｇ阳性１０８例（阳性率１．０７％），抗－ＨＢＣ单独阳性７６７例（阳性率 ７．６７％）。１００８０例献血者中筛查出２５例血浆ＨＢｓＡｇ检测阴性ＨＢＶＤＮＡ检测阳性的隐匿性ＨＢＶ 携带者。隐匿性ＨＢＶ感染者的发生率为０．２５％。ＨＢＶ基因ｃ型１２例（４８％），基因Ｂ型１３例 （５２％），未发现其他基因型。基因Ｂ型和基因Ｃ型之间没有明显的统计区别（Ｐ＞０．０５），序列分析显 示其中５例在ＨＢｓＡｇ“ａ”表位（ａａｌ２４一ａｎｌ４７）存在突变（２０％）。结论我国无偿献血中存在较高比 例的隐匿性乙型肝炎感染，且不同地区的基因型与突变情况存在差异。 【主题词】肝炎病毒，乙型；感染；表位；突变；基因型；供血者 Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆ ｏｃｃｕｌｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇｖｏｌｕｎｔａｒｙ ｂｌｏｏｄｄｏｎｏｒｓｉｎ Ｌｉｓｈｕｉ ａｒｅａ Ｊ／Ｙｏｎｇ－ｐｉｎｇ，ＺＨＡＯ ｂ增－ｙｏｕ，ＺＨＯＵ Ｂｉｎ，ＺＨＯＮＧ Ｍｅｉ—ｌｉａｎ，ＺＨＵＡＮＧ胁，Ｙｕａｎ Ｑ眦ｎ． ＬｉｓｈｕｉＢｌｏｏｄＣｅｎ抛ｒ．Ｌｉｓｈｕｉ ３２３０００，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＪｌＹｏｎｇ－ｐｉｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｊｙｐ６６６８８８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｌｔ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＯｃｃｕｌｔｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｖｏｌｕｎｔａｒｙｂｌｏｏｄｄｏｎｏｒｓｈａｓｂｅｅｎｐｌａｇｕｅｄｉｎ ｔｈｅｓｅｒｕｍｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ＤｅｔｅｒｍｉｎｅｄｔｈｅＯＢＩｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓＮｅｓｔ－ＰＣＲａｍｏｎｇｔｈｅｂｌｏｏｄｄｏｎｏｒｓ，ａｎｄｔｈｅｎｌｅａｒｎｅｄｏｃｃｕｌｔＨＢＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｅｄｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｔｈｉｓａｒｅａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １００８０ ｓｅｒｕｍｓｏｆｄｏｎｏｒｓｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｂｙｔｈｅｉｍｐｏｒｔｅｄＡｂｂｏｔｔＨＢｓＡｇｋｉｔａｎｄＢｅｉｊｉｎｇＷａｎｔａｉ ａｎｔｉ－ＨＢｃａｎｄａｎｔｉ－ＨＢｓｒｅａｇｅｎｔｓ，ｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｇｅｎｅａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｂｙｔｈｅｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｅＮｅｓｔ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｍｏｎｇ １０ ０８０ ｃａｓｅｓ ｏｆｕｎｐａｉｄ ｂｌｏｏｄ ｄｏｎｏｒｓ，１０８ ｃａｓｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄＨＢｓＡｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｂｙＡｂｂｏｔｔｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｋｉｔ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ １．０７％），７６７ ｅａｓｅｓ ｗｅｒｅａｎｔｉ—ＨＢｅ ｓｉｎｇｌｅ—ｐｏｓｉｔｉｖｅ （ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｏｆ ７．６７％）．２５ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄｂｌｏｏｄｄｏｎｏｒｓｗｈｏ ｔｅｓｔｅｄｎｅｇａｔｉｖｅｆｏｒｓｅｒｕｍＨＢｓＡｇａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒＨＢＶＤＮＡｉｎｔｈｅ１００８０ｃａｇｅｓ．ＯｃｃｕｌｔＨＢＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅ ｗａｓ０．２５％．１２ ｃａｓｅｓｗｅｒｅ ＨＢＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅＣ（４８％），１３ｅａｓｅｓｗｅｒｅｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｂ（５２％），ａｎｄ ｎｏ ｏｔｈｅｒｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．ＧｅｎｏｔｙｐｅＢｈａｓ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（Ｐ＞０．０５）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ５ｐａｔｉｅｎｔｓｉｎｔｈｅ ＨＢｓＡｇ 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１．３病毒核酸的提取ＨＢｓＡｇ阳性和抗ＨＢｃ阳性而ＨＢｓＡｇ与抗ＨＢｓ阴性标本逐份进行病毒核酸提取，其他血清学模式标本采用１０份混合的方式进行 ＨＢＶ－ＤＮＡ检测及Ｓ基因片段测序ＨＢＶ． ＤＮＡ以不同区域的三套巢式ＰＣＲ（表１）进行检测。所用试剂为日本ＴａＫａＲａＴａｑ“试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司，ＤＲＯＯｌＡ］，按照产品说明进行试剂配制。第一轮ＰＣＲ扩增３５个循环（９４℃４０ ５５℃４０ｓ、７２。Ｃ４０ ８、 ８），第二轮ＰＣＲ采用相同条件扩 增２５个循环，ＰＣＲ产物进行３％凝胶电泳鉴定。Ｓ基因区“ａ“表位片段（ａａｌｌ０一ａａｌ６５）测序由上海英骏生物技术有限公司用ＡＢＩ仪进行。 １．５基因型及ＨＢｓＡｇ“ａ”表位基因突变分析测得的“ａ”表位片段（Ａ）和Ｓ基因片段（Ｓ）序列与各自的基因型参比序列用ＭＥＧＡｖ３．１（Ｗ ｗｗ． ３１００ ＤＮＡ全自动测序 ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ．ｎｅｔ）中的ＣｌｕｓｔＭ方法进行同源列队。同源队列用ＭＥＧＡｖ３．１中的Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法 （Ｋｉｍｕｒａ ｔｗｏ ｐａｒａｍｅｔｅｒ模型）构建进化树，Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 病毒核酸提取。提取试剂盒采用北京金麦格生物技 术有限公司的病毒ＤＮＡ／ＲＮＡ提取试剂盒（磁珠法），按照厂家操作说明在Ｂｅｃｋｍａｎ室全自动工作站系统上完成。 裹１ Ｔａｂ．１ 验证复数为１０００，Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值大于７０％的系统进化分支认为具有较高的可信度。“ａ“表位基因片段按ＨＢｓＡｇ的读码框翻译成氨基酸序列，通过与参比序列的比较分析其氨基酸突变情况嵋１。 Ｂｉｏｍｅｋ ＮＸ实验 三对检测乙肝病毒巢式ＰＣＲ的引物设计情况 Ｔｈｒｅｅｐｆｉｍｅ伟ｓｅｔｓｏｆｎｅｓｔｅｄ—ＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒＨＢＶＤＮＡ ２结果 ２．１ 贼ＨＢｓＡ毒慧篇蔷嚣乳嚣紫篙篙 １００８０ 酶免检测及ＨＢＶ隐匿性感染情况 阳性７６７份（阳性率７．６７％），剩余９２０５份未检出阳性。其中ＨＢｓＡｇ阳性１０８份和抗一ＨＢＣ单独阳 份血浆用进口雅培ＨＢｓＡｇ试剂和北京万泰抗一ＨＢＣ 万方数据 性７６７份，共计８７５例完成了ＨＢＶ—ＤＮＡ逐份多区段检测。１０８例ＨＢｓＡｇ阳性（年龄：２９．７±８．０１，男／女：ｌ：１．０４）标本有５３例（４９．１％）获得ａ表位基因序列，７６７例ＨＢｃＡｂ单独阳性（年龄：３５．８±９．４７，男／女：１．６６／１）标本有２５例（３．３％）获得ａ表位基因序列。另外９２０５例其他反应模式标本以１０例一组等量混合后进行ＨＢＶ．ＤＮＡ检测。 ９９７２例ＨＢｓＡｇ（一）标本中（抗一ＨＣＶ、抗一ＨＩＶ、抗．ＴＰ均为阴性，ＡＬＴ正常），共发现２５例ＨＢＶ－ＤＮＡ（＋）的隐匿性感染者（０．２５％）。２５例均为抗ＨＢｃ单独阳性标本，其他血清学模式标本均未检测出ＨＢＶ—ＤＮＡ阳性标本。 ２．２隐匿性ＨＢＶ感染携带病毒基因型分析 从 １０ ０８０份血浆中采取得１５份ａ序列和１６份ｓ序 列。ＭＥＡＧ３．１软件进化分析测得，ＨＢＶ基因Ｃ型１２例（４８％），基因Ｂ型１３例（５２％），未发现其他基因型。基因Ｂ型和基因Ｃ型之间没有明显的统计区别（Ｐ＞０．０５）。 ２．３ ＨＢｓＡｇ阳性ＨＢＶ感染携带病毒基因型分析 从１０８份ＨＢｓＡｇ阳性血清中采取得５３份序列。ＭＥＡＧ３．１软件进化分析测得，ＨＢＶ基因Ｃ型３１例（５８．５％），基因Ｂ型２２例（４１．５％），未发现其他基因型。基因Ｂ型和基因Ｃ型之间没有明显的统计区别（Ｐ＞０．０５）。 ２．４隐匿性ＨＢＶ感染者表面抗原“ａ” 发现５例 标本（２０％）的毒株序列在该区域发生了异常变异（不包括血清型相关的氨基酸替代）。其中包括１例单独Ｄ１４４Ａ突变（ＨＺＸＺ－５７，Ｃ基因型）；１例Ｔ１３１Ｐ突变（ＨＺＸＺ－４４１，Ｃ基因型）；１例Ｑ１２９Ｈ突 变（ＨＺＸＺ埘５，Ｂ基因型）；１例Ｔ１２６Ａ突变（ＨＺＸＺ－ ４９０，Ｂ基因型）；１例Ｇ１４５宰突变（ＨＺＸＺ－５９０，Ｂ基因型）；在ＨＢｓＡｇ（＋）所获取的５３份序列中，发现１０例标本（１８．９％，型间突变１２６Ｔ除外）在“ａ”表位发生突变，隐匿性ＨＢｖ．感染与ＨＢｓＡｇ阳性感染者在“ａ”表位的突变率无差异（Ｐ＞０．５）。３讨论 隐匿性ＨＢＶ感染是指ＨＢｓＡｇ检测阴性，ＨＢＶ— 万方数据 ＤＮＡ检测为阳性的一种感染情况。目前我国筛查献血者中是否感染ＨＢＶ，主要采用酶联免疫检测ＨＢｓＡｇ，ＨＢｓＡｇ阴性，ＡＬＴ正常的血液为合格血液。多数研究表明ＨＢｓＡｇ阴性献血者中有隐匿性ＨＢＶ感染者，比例在０．０３％一０．３％¨。。 本研究中隐匿性ＨＢＶ感染检测率达到０．２５％，与各个地区隐匿性ＨＢＶ感染情况存在较大差异，这可能与筛选方法与使用的试剂有关。 本研究中隐匿性ＨＢＶ感染的基因型比例无明显的Ｃ型和Ｂ型差异，这与我们以往的研究存在区别。分析２５例隐匿性ＨＢＶ感染的Ｓ基因的“ａ”表位突变分析，隐匿性ＨＢＶ感染（５／２５，２０％）与ＨＢｓＡｇ阳性感染者（１０／５３，１８．９％）在“ａ”表位的突变率无差异（Ｐ＞０．５）。 隐匿性ＨＢＶ感染发生机制有很多可能性Ｈ１，隐匿性ＨＢＶ的分子病毒学研究的很多，ｓ基因“ａ”高突变被认为与隐匿性感染发生机制存在很大关系”１，本研究中并未有此现象。隐匿性ＨＢＶ感染的发生机制还未确切的阐明，在隐匿性ＨＢＶ感染方面还需要进一步的研究。４参考文献 ［１］ＦｏｒｍｉｊｎＪＨ．ＨａｎｓＬｚ。ＢｅｎＢ，ｅｔａ１．ＯｃｃｕｌｔｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｉｎｆｅｃｔｉｏｎ： ¨ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｓｃｅｎａｒｉｏ．Ｖｉｒｏｌ。２００８。５：１４６． 【２］ ＮｏｒｄｅｒＨ，ＣｏｕｒｏｕｅｅＡＭ，ＣｏｕｒｓａｑｅｔＰ，ｃｔａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓｄｅｒｉｖｅｄ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ。 ｓｕｂｇｅｎｏｔｙｐｅｓ，ａｎｄＨＢｓＡｇ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００４，４７： ２８９－３０９． ［３］李平。刘勇，李翠萍，等．合格献血者血浆ＨＢＶ残留情况分 析．临床输血与检验．２００８，１０：２９３－２９６． 【４］张丽，颜丙玉．隐匿性乙型肝炎病毒感染的发生机制和检测． ＣｈｉｎＪＤｉｓＣｏｎｔｒｏｌＰｒｅｖ。２００８，１２：６１４－６１７． ［５］ ＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒＫＭ，ＢａｕｅｒＴ，ＢｏｈｍＳ，ｅｔａ１．Ｈｉｇｈｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆｔｈｅｇｒｏｕｐ—－ｓｐｅｃｉｆｉｃａ・－ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＢｓＡｇ）ａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｔｈｅｖｉｒａｌｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｎｃｈｒｏｎｉｃｖｉｒｕｓｃａｒｒｉｅｒｓｌａｃｋｉｎｇｄｅｔｅｃｔａｂｌｅＨＢｓＡｇｉｎ ∞ｌｘｌｍ．ＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌ，２０００，８１：１１６５・１１７４． （收稿日期：２０１ｌ－０５－２６）