乳酸菌和双歧杆菌制剂对小鼠肠道菌

乳酸菌和双歧杆菌制剂对小鼠肠道菌 第13卷第16期2013年6月1671—1815（2013）16-4497-04 科学技术与工程 ScienceTechnologyandEngineering Vol.13No.16Jun．20132013Sci.Tech.Engrg. 医药卫生 乳酸菌和双歧杆菌制剂对小鼠肠道菌群 失调模型的调节作用 伍 静 苏春萍 王显超 杨静谊 贺 超 李维国 * （第四军医大学训练部，西安710032） 摘要利用抗生素干扰小鼠肠道原籍菌群，建立小鼠肠道菌群失衡模型；并利用乳酸菌和双歧杆菌制剂对肠道菌群失调小 对小鼠进行鼠模型进行调节治疗。观察乳酸菌和双歧杆菌对肠道菌群失调模型的调节效果。选用不同浓度的头孢曲松钠， 口服6周灌胃。取盲肠和结肠内容物培养主要菌群变化。模型制备成功后利用乳酸菌和双歧杆菌进行菌群的治疗性调节，后，被检菌群的数量。结果不同剂量头孢曲松钠灌胃的小鼠盲肠体积均有所增大，模型组的优势菌的数量显著减少。通过口服乳酸菌和双歧杆菌制剂，可以适当的恢复乳酸菌和双歧杆菌的数量。与对照组比较差异显著。说明实验成功地制备模拟长期应用抗生素的机能环境，通过外源性的补充乳酸菌和双歧杆菌，对保持肠道菌群的平了小鼠的肠道菌群失衡模型，衡具有调节和修复作用。关键词 乳酸菌 双歧杆菌Ｒ378.91； 抗生素 菌群失调B 中图法分类号 文献标志码 哺乳动物肠道内存在数量庞大、结构复杂的正常菌群，对宿主具有营养、免疫和生物拮抗等作用 ［1］ 建立肠道菌群失调的动物模型，在此模型的基础上利用乳酸菌和双歧杆菌制剂对肠道菌群失调进行修复，为肠道菌群的平衡调节和对微生态的深入研究奠定基础。 。肠道正常菌群失调常见于长期应用抗生素 后，对药物敏感的菌群死亡或被抑制，而对药物不敏感的菌群会得到快速繁殖，破坏原有平衡的一种症状。研究明当正常菌群失调后对机体的正常代谢及抗感染能力有较大影响。近年来探讨正常菌群与肠道黏膜免疫的关系已成为免疫学及相关肠道菌群失衡与免疫之间的关系学科研究的热点， 越来越受到关注。研究已经证实乳酸菌和双歧杆B2、B6、B12、菌能为宿主提供B1、烟酸、叶酸等维生素和苯甲基丙氨酸、和谷氨酸等氨基酸 ［2，3］ 1 1.1 材料和 实验对象 KM小鼠，8周龄，雌性，体重（20±2）g，购自第 四军医大学实验动物中心（合格证号：SCXK（陕）2012—002），动物饲养于SPF环境设施。动物饮用水为蒸汽高压灭菌消毒，动物饲料为钴60照射处理。1.21.2.1 试剂抗生素 ［4］ 。又由 于乳酸菌和双歧杆菌能产生乳酸和醋酸，降低肠道的pH值，进而抑制腐生菌的生长，所以本实验选用SPF级小鼠作为研究对象，利用抗生素的抑制作用 2013年2月21日收到第一作者简介：伍 * 头孢曲松钠1.2.2 由上海新亚药业有限公司提供， 使用浓度为0.5mg/mL。 乳酸菌和双歧杆菌制剂 双歧杆菌活菌胶囊由丽珠集团丽珠制药厂提供。乳酸菌素片由哈药集团制药六厂提供。1.2.3 培养基和细菌培养 静，女，实验师，研究方向，病原微生物。 mail：liwg@fmmu.edu.cn。通信作者简介：李维国，教授。E- 4498科学技术与工程13 卷 伊红美蓝培养基（EMB）用与选择大肠杆菌；肠球菌选择培养基（胆盐-七叶苷-叠氮钠琼脂）用于选择肠球菌；乳酸杆菌选择培养基（MＲS）用于选择乳酸杆菌；双歧杆菌选择培养基（BBL）选择双歧杆菌。1.31.3.1 方法实验分组 将小鼠随机分为实验对照组，头孢曲松小剂量组，中剂量组，大剂量组。实验组每组15只，对照组为10只，共55只小鼠。动物取回后，先进行适应性饲养2d，对照组小鼠用生理盐水灌胃，每次0.5mL，早晚各一次。模型组中，第一组为头孢曲松钠小剂量组100mg/mL、第二组为中剂量组200mg/mL、第三组为大剂量组400mg/mL进行配置，对照组仅用生理盐水进行灌胃。2周后每周取5只小鼠，脱臼处死取小鼠回盲部内容物，准确称量后，按照比例稀释，判定模型制备效果。模型制备成功后，实验模型成功组中取5只为调节治疗组，利用乳酸菌和双歧杆菌制剂配置的饮水进行治疗性调节；剩余的5只小鼠用于自然恢复组，连续2周后，按照相同的方法处死剩余动物并进行细菌计数。如图1所示。 乳酸菌、双歧杆菌的菌落数，并以每克盲肠内容菌、 物中菌落数的常用对数表示。1.3.4 双歧杆菌和乳酸杆菌的调节治疗 模型制备成功后，在小鼠的饮用水中加入双歧 5 双歧杆菌的浓度为10CFU/mL，杆菌和乳酸杆菌， 4 乳酸菌的浓度为10CFU/mL。进行口服调节，连续 4周后。用相同的方法检测小鼠回盲部四种菌群的数量。1.3.5 细菌的培养与鉴定 伊红美蓝培养基（EMB）上37℃，培养24h，计镜检革兰氏阴性的所有菌落计为大肠数发酵乳糖， 杆菌的数量；胆盐-七叶苷-叠氮钠琼脂37℃培养48h，计数具有明显黑色晕圈，镜检革兰氏阳性的所有菌落计数为肠球菌；MＲS培养基37℃兼性厌氧48h，镜检革兰氏阳性，形态规则，无芽孢的所有菌落均计数为乳酸杆菌；BBL培养基37℃厌氧培养48h，镜检革兰氏阳性，形态不规则，无芽孢，过氧化物酶阴性的所有菌落均计数为双歧杆菌。1.3.6 统计分析 主要指标进行正态性分析，正态分布各统计资 珋±s表示，料均以x两组比较差齐性采用T检验，方差不齐采用校正T检验。以P＜0.05为统计学显著差异。 2 2.1 图1 实验流程示意图 结果 头孢曲松钠对小鼠肠道正常菌群的变化与正常小鼠肠道菌群进行比较，小鼠口服底、 中、高剂量的头孢曲松钠后，肠道内四种细菌的数量明显改变，正常菌群的平衡遭到了破坏，形成菌群失调。特别是在头孢曲松钠的三个剂量中，以中剂量组和高剂量组较为典型（表1）。其中部分小鼠还出现腹泻等症状。 表1 组别 N5555 低剂量中剂量高剂量正常对照组 1.3.2标本的采集与稀释 小鼠脱臼处死后，在超净工作台中取小鼠回盲部内容物并将回盲部内容物称量，加入到含4mL的震荡裂解。裂解液用无无菌生理盐水的离心管中， －4 10－6、10－8三个稀释度菌生理盐水稀释至10、 各组菌群定量检测结果比较（lg10） 大肠杆菌 2.85±0.02 肠球菌5.50±0.23 乳酸杆菌4.80±0.11 双歧杆菌2.58±0.09 备用。1.3.3 细菌的计数与培养 不同稀释度的稀释标本各取200μL进行计数，将涂布的培养平板放置于37℃培养箱内进行培养。待菌落形成后，以菌落形态和生化反应管鉴定细菌并计数。折合成每克盲肠内容物中大肠杆菌、肠球 1.37±0.31＊＊3.95±0.344.09±0.31＊＊1.18±0.17＊＊———＊＊3.48±0.27＊＊3.19±0.27＊＊———＊＊ 3.81±0.127.26±0.037.37±0.085.65±0.20 ＊＊ P＜0.01。注：与正常对照组比较， 16期伍等：乳酸菌和双歧杆菌制剂对小鼠肠道菌群失调模型的调节作用静，4499 2.2乳酸杆菌和双歧杆菌制剂对肠道正常菌群失调小鼠的调节作用 根据模型制备情况，选取头孢曲松钠中剂量组 降的影响。肠道正常菌群能降低胰蛋白酶的活性，解胆固醇，增加对无机物的吸收，合成一些维生素；并且肠道菌群的平衡，能保护小鼠抵御外来微生物，的侵袭，形成“定植抗力”抵御外来微生物的侵袭 ［9］ 为模型组，同时用剩余的10只对照组小鼠中取出5只用于调节对照（自然恢复）组。将乳酸菌和双歧杆菌制剂用无菌水配制成相应浓度后，让小鼠自由饮水、饮食，连续2周，而后停药2d换用正常无菌观察小鼠状态的变化，并按照相同的方法无菌水， 取小鼠回盲部内容物并检测细菌的数量（表2）。调解对照组与对照组间没有差异，而调解组通过连续两周的乳酸菌和双歧杆菌制剂的调节，基本恢复到了模型制备前的水平。 表2 N555 。 多数细菌在同一环境中生存，相互间的生物拮抗可以避免某一种细菌尤其是致病菌或条件致病菌成为优势菌，对机体造成不良的影响。在建立肠道菌群失调的动物模型时，采用头孢曲松钠不同剂量作用于屏障设施内饲养的SPF小鼠，可以避免环境因素对实验体系的影响，连续作用于KM小鼠2周后，肠道菌群显著减少，成功制备了小鼠肠道菌群失调模型，其中中高剂量组的小鼠并伴有轻微腹泻等症状。后续实验中，利用乳酸菌和双歧杆菌活菌制剂进行调节性治疗，外源性的乳酸杆菌和双歧杆菌活菌制剂进入机体，定植于肠道，重塑了肠道菌膜。使得所检测的菌群数量重新达到平衡的状态。 双歧杆菌是人体肠道正常菌群中的优势菌种，主要分布在结肠黏膜表面，通过胞壁酸与肠黏膜上皮细胞相互作用密切结合，与其它厌氧菌一起共同占据肠黏膜表面，形成一个生物学屏障，构成肠道阻止致病菌、条件致病菌的定植和入的定植抗力，侵 ［10］ 乳酸杆菌和双歧杆菌制剂对肠道正常菌群失调小鼠的作用 组别调节治疗组自然恢复组对照组 大肠杆菌肠球菌 3.78±0.578.43±0.17乳酸杆菌867±0.54双歧杆菌6.16±0.27 2.92±0.156.32±0.145.31±0.123.25±0.333.56±0.268.14±0.397.26±0.205.97±0.56 从上述结果可以看出，临床上由于长期使用抗生素时应及时补充外源性的乳酸杆菌和双歧杆菌，对于保护肠道正常菌群的平衡，防止菌群失调有一定的调节作用。适当的给予添加乳酸杆菌与双歧杆菌的制剂。对维持动物机体肠道菌群的均衡有非常显著的意义。 。在肠道内，有厌氧菌和需氧菌，厌氧菌是常 3讨论 抗生素是临床治疗感染性疾病的主要药物，但 住菌，而需氧菌和兼性厌氧菌则多为过路菌。前者占优势，但又依赖后者消耗氧气，保证其生态条件。肠道对外来微生物的阻抗力来源于肠菌群的厌氧菌部分。正常的动物肠道中的厌氧菌占绝对的优势。正常菌群中的厌氧菌水平高，定植能力就高，厌氧菌特别是双歧杆菌与乳杆菌是生理细菌，能产生各类有机酸如乳酸、醋酸等，可抑制许多致病菌与条件致病菌。本实验通过抗生素制备的肠道菌群失调模型在一定程度上反映了机体菌群失调病并利用外源性的添加部分有益的活症的一些特征， 菌制剂能在短时间内使得多种菌群的达到均衡。说明在临床长期使用抗生素的情况下，适当的补充外源性有益活菌制剂可适当的调节肠道菌群的平衡，有利于疾病的康复。 长期大量使用抗生素治疗的患者，会导致肠道微生态失调，造成临床伴发性的腹泻，引起二重感染症状，给治疗带来一定的困难 ［5，6］ 。肠道菌群与动物 机体的健康有着密切的关系，动物出生后，肠道内首先出现大肠杆菌为首的需氧和兼性厌氧菌的优势菌群，他们消耗氧气，降低了肠道局部的氧化还原电势（Eh），促进双歧杆菌这类厌氧菌在肠道的定植，并发酵糖类，产生乙酸和乳糖，抑制大肠杆菌和肠球菌的繁殖，从而达到菌群均衡的状态 ［7，8］ 。在 肠道菌群处于平衡的状态下，对机体是有益的，但是在菌群中的每一种细菌所起的作用不同。胃肠道的生理生化功能均受到肠道正常菌群代谢活动 4500科学技术与工程13卷 womenwithnormalormoderatelyelevatedcholesterol.JDairyＲes， 参 1 考文献 67 2009；76（4）：469—474 鞠宝玲，唐小云，张红军，等.菌群失调小鼠全身及肠道局部免疫2008；8（5）：445—446，449功能的实验研究.热带医学杂志， ZamfirM，Grosu-TudorS.ImpactofstressconditionsonthegrowthofLactobacillusacidophilusIBB801andproductionofacidophilin2009；55（4）：277—282801.JGenApplMicrobiol，8 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5AndradeS，BorgesN.EffectoffermentedmilkcontainingLactobacil-lusacidophilusandBifidobacteriumlongumonplasmalipidsof TheＲegulatedEffectofLactobacillusandBifidobacterium PreparationofMiceIntestinalFloraDisequilibriumModel WUJing，SUChun-ping，WANGXian-chao，YANGJing-yi，HEChao，LIWei-guo* （DepartmentofTraining，TheFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，P．ＲChina） ［Abstract］Useofantibioticsinterferencemiceintestinalbonafideflora，theestablishmentofyourdegreeofflo- raimbalancemicemodel．Useoflactobacillusandbifidobacteriumtointestinaldysbacteriosismiceregulation．Ob-servationlacticacidbacteriaandbifidobacteriaonintestinalfloradisequilibriummodelregulationeffect．Differentconcentrationofceftriaxone，themicelavageisChoosed．Cecumcontentculturemainflorachangesistake．Afterthesuccessofthemodelforthepreparationofusinglacticacidbacteriaandbifidobacteriainfloraoftherapeuticad-justment，oral6weeksafterthetest，thefloranumberisdetected．Differentdosagesceftriaxonelavageinmicehavebeencecumvolumeincreases．Theadvantageofthemodelgroupwassignificantlyreducedinthenumberofbacteri-a．Throughorallactobacillusandbifidobacteriumpreparation，canproperrecoverylactobacillusandbifidobacteriumquantity．Significantdifferencecomparedwithcontrols．Itisconclusedthatexperimentsuccessfulpreparationmousetermuseofantibiotics，thefunctionoftheenvironmentthroughintestinalfloraimbalancesimulationmodel，long-theexternalsupplementlacticacidbacteriaandbifidobacteria，tokeepthebalanceoftheintestinalflorahasregula-tionandrepairaction．［Keywords］bifidobacterium Lactobacillus floradisequilibrium animalmodel