颅骨修复钛网表面PDACPP涂层的制备

Material Sciences 材料科学, 2017, 7(1), 134-142 Published Online January 2017 in Hans. Study on Preparation and Properties of PDA/CPP Bilayer on Skull Repairing Titanium Mesh Jiamin Zhang, Tao Wang*, Chunbo Tang College of Material Science and Technology, Nanjing University of Aeronautics and Astronautics, Nanjing Jiangsu ththndReceived: Jan. 7, 2017; accepted: Jan. 19, 2017; published: Jan. 22, 2017 Copyright © 2017 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). Open Access Abstract To obtain excellent hydrophilicity and superb biomineralization capability, polydopamine/casein phosphopeptides (PDA/CPP) bilayer was prepared through a simple two-step immersion process. The adhering PDA interlayer linked the natural biomolecules, CPP, to the SLA titanium surface via covalent bonds. The bilayer was characterized by AFM, XPS and contact angle analyzer. FESEM and EDS were utilized for analyzing the effect of biomimetic mineralization. Our results indicated that PDA/CPP was successfully coated on skull repairing titanium mesh through two-step immersion without any toxic element induced. The bilayer enhanced the hydrophilicity and the rate of bio-mineralization significantly. Keywords Skull Repairing Titanium Mesh, Ploydopamine, Casein Phosphopeptides, Hydrophilicity, External Biomimetic Mineralization 颅骨修复钛网面PDA/CPP涂层的制备及性能研究 张嘉敏，汪 涛*，汤春波 通讯作者。 文章引用: 张嘉敏, 汪涛, 汤春波. 颅骨修复钛网表面PDA/CPP涂层的制备及性能研究[J]. 材料科学, 2017, 7(1): 134-142. 张嘉敏，汪涛 南京航空航天大学材料科学与技术学院，江苏 南京 收稿日期：2017年1月7日；录用日期：2017年1月19日；发布日期：2017年1月22日 摘 要 本文意在探究一种简易高效的应用于颅骨修复钛网表面的生物化学改性方法。首先通过浸泡法在钛网表面沉积聚多巴胺薄膜层(PDA)，其次利用PDA的超强粘附性和二次修饰功能，进一步接枝酪蛋白磷酸肽(CPP)，制备具有优良亲水性及优良生物矿化能力的复合涂层。利用XPS、AFM、接触角仪进行涂层表征；浸泡模拟体液(SBF)，利用FESEM及EDS分析体外仿生矿化效果。结果显示，“两步浸泡法”成功将PDA与CPP依次修饰于颅骨修复钛网，无毒性元素引入；与未修饰表面相比，具有PDA/CPP生物活性涂层的表面亲水性得到显著提高，并且能够在1天之内诱导沉积均匀稳定的类骨羟基磷灰石(HA)。 关键词 颅骨修复钛网，聚多巴胺，酪蛋白磷酸肽，亲水性，体外仿生矿化 1. 引言 颅骨是脑组织重要的支撑和防护部位，外力破坏、脑疾病手术以及先天性颅骨缺损是导致颅骨缺损的主要原因[1]。目前，颅骨修复材料有钛网、硅橡胶板、骨水泥、高分子纤维增强材料等。其中，数字化成形三维钛网具有比重轻、机械强度高、生物相容性和耐腐蚀性优良的特点，同时又具有手术时间短，使用钛钉数量少，外观满意度高，术后并发症少等优点，是目前颅骨修补手术的首选材料[2]。 然而，惰性的天然钛表面无法与骨组织产生强有力的化学骨结合，颅骨修复钛网需要进行表面改性以缩短颅骨愈合周期，加快早期骨整合，获得更高的结合强度[3] [4]。喷砂、蚀刻等物理方法，容易导致薄层曲面植入体变形；等离子喷涂、电化学沉积等化学方法工艺复杂，同时极易引入有毒杂质，二者对颅骨修复钛网皆不具有适用性。生物化学方法适用性广、操作简单、绿色环保，对结构复杂的植入体具有优越性。 受海洋贻贝蛋白粘附机理的启发，Lee等[5]研究发现，含有儿茶酚官能团和赖氨酸端氨基官能团的多巴胺(dopamine)，在碱性条件下，通过简单地浸泡即可在玻璃、金属、陶瓷、有机物等几乎任何材料表面，迅速形成具有超强黏附性的聚多巴胺(Polydopamine, PDA)薄膜。PDA薄膜能够有效提高材料表面耐腐蚀性、生物相容性并能促进钙离子的沉积[6]，同时，其氧化自聚合过程中形成的醌式结构与生物大分子的伯氨基发生席夫碱反应，或者通过苯环上的碳与具有亲核特性的生物大分子发生迈克尔加成反应，可将生物大分子固定在材料的表面，进行功能性二次修饰[7] [8]。近年来，利用PDA将RGD肽、肝素、酶、骨形态发生白(BMP-2) [9] [10] [11]固定于植入体材料表面的生物化学改性研究逐年增加[12]。 酪蛋白磷酸肽(Casein phosphopeptides, CPP)是以牛乳酪蛋白为原料，通过水解、分离、纯化而成的天然活性多肽，能够有效促进人体对钙的吸收和利用，被称为“矿质载体”，是目前唯一一种促进钙吸收的活性肽[13]。CPP由丝氨酸、谷氨酸和磷酸基构成，磷酸基能够与钙离子结合成可溶性复合物，提高局部钙含量，促进羟基磷灰石的沉积，增强成骨细胞的黏附与增殖[14]。此外，CPP还可减弱破骨细胞的作用，使得成骨细胞在骨代谢中起主导作用，阻止矿物质的流失和抑制骨的再吸收[15] [16]。 张嘉敏，汪涛 本文在颅骨修复钛网表面沉积PDA薄膜，并以PDA为平台，进一步接枝CPP，形成PDA/CPP生物活性涂层，意在探究一种简易、环保、促进早期骨整合、适用于钛基复杂结构植入体的生物化学表面处理方法。 2. 实验 2.1. 材料及试剂 人字形颅骨修复钛网(TA2)够自深圳三和兴五金公司；盐酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)购买自南京化学试剂有限公司；盐酸多巴胺、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、N-羟基酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDS)购买自阿拉丁试剂有限公司；酪蛋白磷酸肽购买自河南喜莱客化工产品有限公司。 2.2. 颅骨修复钛网表面PDA薄膜的沉积以及CPP的固定 将颅骨修复钛网切割成3 cm × 3 cm的正方形薄片，厚0.5 mm，用砂纸逐层打磨，用去离子水、丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗15 min并吹干，获得清洁表面，记为Ti。将多巴胺溶于Tris-HCl缓冲溶液，配制pH = 8.5，浓度为2 mg/ml的多巴胺溶液。将清洗之后的样品在该溶液中浸泡24 h，取出后用去离子水超声清洗5 min并吹干，记为Ti/PDA。将MES、EDS、NHS依次加入到去离子水中，浓度分别为0.1 mol/L、20 mmol/L、50 mmol/L，向该溶液中添加CPP，配制10 g/L的CPP溶液。将Ti/PDA试样在CPP溶液中浸泡16 h，取出后用磷酸缓冲溶液(PBS, PH = 7.4)冲洗并吹干，记为Ti/PDA/CPP。 2.3. 表面仿生矿化实验 将Ti、Ti/PDA、Ti/PDA/CPP三组样品浸泡在模拟体液(1:1, pH = 7.4)中，放置于温度为37.5℃的恒温箱中，1天(1 d)取出样品进行表面分析测试。 2.4. 表征与测试 使用接触角测量仪(JC2000D7M)测量样品表面与蒸馏水的静态接触角；使用X射线光电子能谱仪(XPS，PHI QuanteraⅡ，日本)对样品表面元素进行分析；使用原子力显微镜(AFM，CSPM5500，本原纳米仪器有限公司)分析样品表面结构及粗糙度；使用能谱仪(EDS)以及场发射扫描电镜(FESEM，LEO-1550，德国)分析改性前后表面仿生矿化效果。 3. 结果与讨论 3.1. XPS成分分析 图1，图2分别是Ti、Ti/PDA以及Ti/PDA/CPP三组试样表面的XPS全谱图以及O1s高分辨谱图。由图1可知，Ti表面除Ti2p (458.8 eV)峰外，还存在O1s (530.5 eV)峰、C1s (285 eV)峰以及强度很小的N1s (400 eV)峰，这归属于空气中吸附于样品表面的污染物；Ti/PDA试样表面，Ti2p峰强度急剧下降，N1s峰强度增加，这是由于多巴胺富含氨基官能团，表明Ti表面完全被PDA覆盖；Ti/PDA/CPP试样表面，N1s峰强度继续增加，同时在结合能为189 eV以及131 eV处分别出现的P1s和P2p特征峰，这是由于丝氨酸、谷氨酸富含氮元素，而磷酸基富含磷元素，表明CPP成功接枝在Ti表面。 由图2可知，在Ti表面，由于二氧化钛钝化层的存在，结合能为530.6 eV的Ti-O特征峰所占比例最大，而归属于表面有机污染物的C-O (532.7 eV)和C=O (321.7 eV)显然所占比例较小。Ti/PDA表面Ti-O特征峰比例显著减小，而C-O和C=O特征峰所占比例显著增大，进一步说明含有醌基以及其他多巴胺衍 张嘉敏，汪涛 Figure 1. XPS wide scan spectrum of different surfaces (A) Ti, (B) Ti/PDA, (C) Ti/PDA/CPP 图1. 不同试样表面XPS全谱图(A) Ti，(B) Ti/PDA，(C) Ti/PDA/CPP 生物的PDA薄膜层的存在。Ti/PDA/CPP样品表面Ti-O特征峰强度继续减弱，C-O和C=O的特征峰强度继续增强，尤其是C=O特征峰，这与上文所述CPP的接枝使得表面酰胺键的数量增加一致，因而也进一步说明了样品表面被CPP生物活性涂层所覆盖。 3.2. AFM形貌表征 随机选取试样表面1 um × 1 um区域进行AFM分析,利用扫面探针显微镜系统对样品断面的粗糙度变化进行分析，如图3所示。Ti表面由于砂纸的打磨，存在细小尖锐的突起，；沉积PDA薄膜之后，尖锐区域减少，绝大部分区域棱角不明显，形貌虽然有起伏但趋于柔和平整；浸泡CPP溶液后突起完全被涂层覆盖，在基底表面沿划痕形成上下起伏的形貌。从轮廓线可知，由于样品基底皆因打磨存到平行的划痕，因而三种表面的轮廓线都存在稳定的上下起伏，峰顶和峰谷交错。未改性的Ti表层断面呈现不规则的锯齿状，峰尖锐，不平整，最小二乘中线约为72 nm；Ti/PDA样品表层断面虽然红线数值并没有明显变化，但是杂乱的锯齿状峰减少，轮廓变得圆润，说明表面确实被PDA薄膜层所覆盖，PDA贴合于基底表面；Ti/PDA/CPP表面断层轮廓线起伏大，但是十分平缓圆润，红线数字出现明显变大(约240 nm)，可见表面粗糙度增加，表面被与Ti/PDA表面相比更加厚重的涂层所所覆盖。 张嘉敏，汪涛 Figure 2. High resolution XPS spectrum of O1s on different surfaces (A) Ti, (B) Ti/PDA, (C) Ti/PDA/CPP 图2. 不同试样表面O1s高分辨XPS图谱 (A) Ti，(B) Ti/PDA，(C) Ti/PDA/CPP 3.3. 亲水性分析 亲水性是医用材料生物相容性的一个重要指标。在水接触角实验中，每一种样品选取三个，每一个样品表面分别随机选取三点进行水接触角测试，对得到的同种表面的9个数据去掉最大值及最小值取平均数，最为该种表面的水接触角。图4是光滑纯钛表面改性前后水接触角测试分析图。如图所示，Ti表面接触角有90.3˚，修饰了PDA薄膜层之后，接触角降至53.8˚，亲水性明显增强，这是由于PDA中富含亲水的酚羟基(-OH)和氨基(-NH2)基团。Ti/PDA/CPP样品的接触角相比于Ti/PDA表面又显著减小，原因在于CPP涂层中同样含有亲水性的氨基(-NH2)、羟基(-OH)、羧基(-COOH)等基团，与PDA相比亲水基团的种类更多，因而PDA/CPP复合涂层亲水效果更加显著。 3.4. 体外仿生矿化性能分析 3.4.1. 沉积物表征 浸泡SBF溶液1 d后，部分试样表面沉积了的1 um左右、白色、均匀的疏松球状颗粒，如图5(A)所示，与羟基磷灰石的形态一致[17]。对此白色沉积物进行EDS分析，如图5(B)所示，表面沉积物中主 张嘉敏，汪涛 剖面线 120.00 100.00 高度(nm)80.0060.0040.00 20.00 0.000.00 4000.00 8000.00 12000.00 16000.00 宽度(nm) [蓝线为轮廓线/红线为最小二乘中线] 200.00 高度(nm)剖面线150.00100.0050.00 0.000.00 4000.00 8000.00 12000.00 16000.00 宽度(nm) [蓝线为轮廓线/红线为最小二乘中线] 剖面线350.00 300.00 250.00 200.00 150.00 100.00 50.00 0.000.00 4000.00 8000.00 12000.00 16000.00 宽度(nm) [蓝线为轮廓线/红线为最小二乘中线]高度(nm) Figure 3. AFM photographs of specimens (A) Ti, (B) Ti/PDA, (C) Ti/PDA/CPP 图3. 试样表面AFM分析图(A) Ti，(B) Ti/PDA，(C) Ti/PDA/CPP Figure 4. Contact angles with pure water of different surfaces (A) Ti, (B) Ti/PDA, (C) Ti/PDA/CPP 图4. 不同表面水接触角测试示意图(A) Ti，(B) Ti/PDA，(C) Ti/PDA/CPP 要元素为P、Ca、O，Ti元素来自于Ti基底，极少量的Na、Mg、Si来自于模拟体液及实验过程中引入的杂质，钙磷原子百分比之比(Ca/P)为1.66，与羟基磷灰石原子比1.67想接近，进一步证明表面沉积羟基磷灰石(HA)。 3.4.2. 矿化表面FESEM分析 材料表面能够诱导羟基磷灰石的沉积，是材料具有诱导骨生长能力的重要标志。图6分别是3组不 张嘉敏，汪涛 Figure 5. FESEM image and EDS spectra of the deposit on the specimens immersed in SBF 图5. 浸泡SBF后试样表面沉积物高倍FESEM图以及EDS谱图 Figure 6. FESEM images of different samples immersed in SBF for 1 d (A) Ti, (B) Ti/PDA, (C) Ti/PDA/CPP 图6. 体外仿生矿化1 d后各样品表面FESEM图(A) Ti，(B) Ti/PDA，(C) Ti/PDA/CPP 同处理方式的颅骨修复钛网浸泡1 d后，表面羟基磷灰石沉积状况的FESEM图。未处理的钛网表面无任何变化；Ti/PDA表面也无明显变化，虽然PDA薄膜表面裸露的羟基基团能够螯合Ca2+，为HA提供形核位点，促使HA的沉积[18]，但是SBF中Ca2+浓度低，因而促进效果不明显；Ti/PDA/CPP浸泡SBF溶液1 d后表面完全被大小均匀的球状HA覆盖，局部区域球形颗粒逐层堆积，向上蔓延生长，形成三维多孔的HA支架，并且无任何开裂痕迹。这是由于表面CPP中的磷酸丝氨酸能够与Ca2+形成可溶性复合物，增加试样周围游离Ca2+的浓度；均匀分布于表面的磷酸丝氨酸起模板剂作用，为HA 提供密集的形 张嘉敏，汪涛 核位点；同时，PDA中的酚羟基对Ca2+同样具有螯合作用，当SBF溶液渗透到PDA层，PDA中残余的酚羟基也能够固定Ca2+，促进HA形核。HA与基底表面PDA/CPP复合涂层之间的共价结合同时也增加了界面结合强度。形核速度快，晶核数量多，并且覆盖样品表面的HA颗粒继续长大的同时又将为新一层的HA提供形核位点，因而形成HA颗粒逐层堆叠的形貌。球状HA颗粒尺寸小，较为独立，内应力小，因而HA层稳定，不容易破裂。 4. 结论 先后浸泡碱性多巴胺溶液及酪蛋白磷酸肽溶液，能够有效地在颅骨修复钛网表面修饰PDA/CPP生物活性涂层，并且无毒性元素引入；该涂层可使钛网表面水接触角从90.3˚降低至30.5˚，显著提高颅骨修复钛网表面的亲水性；体外仿生矿化实验表明，在SBF中，PDA/CPP涂层能够在1天之内迅速诱导HA沉积，均匀的球状HA堆叠生长，形成有利于骨组织生长的三维多孔支架状，促进早期骨整合；同时，该涂层能够增强HA与基底的结合力，显著减少开裂与脱落，增强界面稳定性。这种生物化学改性方法成本低，操作简便，绿色环保，同时由于多巴胺在各种材料上的成膜性能，PDA/CPP生物化学改性方法有望在其他植入材料表面应用，具有重要的探索价值。 基金项目 中央高校基本科研业务费项目(NP2012303)；江苏高校优势学科建设资助项目。 参考文献 (References) [1] 王玮竹, 朱晏军, 闫玉华. 颅骨修复材料的研究进展[J]. 化工新型材料, 2014, 32(9): 21-23. 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