通络救脑注射液中有效成分对小胶质细胞的影响

通络救脑注射液中有效成分对小胶质细胞的影响 　　　　小胶质细胞是中枢神经系统唯一具有免疫活性的细胞。生理条件下，小胶质细胞处于相对静息状态，呈分支状，胞体小，具有伸向各个方向的细胞突起，可分泌和释放生长因子，维持神经元生存、生长和分化。同时，小胶质细胞通过其突起不断监测着大脑微环境的变化，呈现出小胶质细胞直接与神经元的多个突触裂直接接触的状态。小胶质细胞与神经元的这种结构是维持大脑功能正常的生理基础，同时也是病理损伤的关键环节。缺血性中风严重危害着人类健康，随着对该病的临床观察与实践，逐渐形成了缺血性中风 “毒损脑络”的病机假说。通络救脑注射液是针对缺血性脑中风 “毒损脑络”病机而研发的，既往研究结果显示，其能够有效增加脑微血管内皮细胞的活性、改善其分泌状态，发挥脑保护作用，其主要有效成分为栀子苷和人参皂苷 Rg1。本文探讨这两种有效成分对小胶质细胞的影响，明确中药有效组分配伍治疗缺血性中风的可能药效学机制。 　　1 材料 　　1. 1 药品与试剂通络救脑注射液由天津红日药业股份有限公司提供，批号为 090602，由栀子和三七提取配制而成，含总有效成分 7. 7mg/ml，其主要有效成分为栀子苷 4. 95mg/ml，人参皂苷 Rg1 1. 02mg/ml。栀子苷 ( 批 号 090602) 及 人 参 皂 苷 Rg1 ( 批 号110703-201027) 由中国食品药品检定研究院提供，2- ( 2-甲氧基-4-硝苯基) -3- ( 4-硝苯基) -5- ( 2，4-二磺基苯) -2H-四唑单钠盐 ( CCK-8) 试剂 ( 批号 CK04-11) 购于日本同仁化学研究所，乳酸脱氢酶 ( LDH) 试剂盒 ( 批号 C0016) 购于碧云天生物技术研究所，caspase-3 ( 批号 BS7004) 购于Bioworld 公司，β-actin ( 批号 ab1801) 购于 Abcam公司，N-甲基-D-门冬氨酸受体 ( NMDAR1，批号2329-1) 购于 Epitomics 公司，二抗均购自中杉金桥公司。小鼠小胶质细胞株 BV2 及神经元细胞株Neuro-2a 购自上海延诚生物科技有限公司。 　　1. 2 主要仪器Thermo 3111 二氧化碳培养箱，赛默飞世尔科技公司; Infinite 200 全波长多功能酶标仪，Tecan帝肯公司; TDL-5-A 型低速离心机，上海金鹏分析仪器有限公司; 3K30G 型超速冷冻离心机，Sigma公司; 1658001 型 垂 直 电 泳 仪，Bio-Rad 公 司;Phoretix 1D 凝胶分析系统，GE health 公司。 　　2 方法 　　2. 1 细胞培养小鼠小胶质细胞株 BV2 及神经元细胞株Neuro-2a ( 1. 5 × 105个/ml) 以含有 10%胎牛血清的高糖DMEM / F12 的培养基种植于底面积为 75cm2的培养瓶内，置于 5% CO2、37℃ 饱和湿度孵箱培养，长成 80% 融合状态时以 0. 25% 胰酶 ( 含 0. 02%EDTA) 消化传代，每 3 天传代 1 次。 　　2. 2 氧糖剥夺模型建立采用糖氧剥夺模型，小胶质细胞或神经元细胞传代 48h 后，用无糖的 DMEM 培养液置换原培养基，放入低氧培养箱 ( 气体含量为 93% N2，7% CO2) ，37℃继续培养 6h。 　　2. 3 小胶质细胞条件培养液制备将第三代的小胶质细胞调整细胞密度为 1 ×106/ml，接种至 5 个 75cm2的培养瓶中，分为正常对照组、氧糖剥夺组、通络救脑注射液组、栀子苷组、人参皂苷 Rg1 组。除正常对照组外，其余4 组进行氧糖剥夺处理，通络救脑注射液组、栀子苷组和人参皂苷 Rg1 组分别加入终浓度为 40μg/ml、25 μg / ml 和 5 μg / ml 对应的药物( 各有效组分终浓度与通络救脑注射液组中的终浓度一致，即按比例折算) ，作用6h 后收集各组的培养液，并于室温下 1000转/min 离心除去细胞碎片，收集上清液后备用。 　　2. 4 分组与给药将神经元细胞分为正常对照组、氧糖剥夺组、正常条件液组、氧糖剥夺条件液组、通络救脑条件液组、栀子苷条件液组、人参皂苷 Rg1 条件液组，其中正常对照组采用常规神经元培养液，氧糖剥夺组采用无糖 DMEM 培养液，其余 5 组按照处理条件分别使用对应的小胶质细胞条件培养液，条件培养液添加为 100%，神经元各组所用细胞量及复孔数根据不同的实验检测指标而定，作用时长为 6h。 　　2. 5 神经元细胞活性检测将密度为 1 × 105/ ml 的神经元细胞接种至 96孔板，每组 6 个复孔，经各种小胶质细胞的条件液孵育结束后，各组弃去原培养液，各孔统一换成DMEM / F12，并加入 10 μl CCK-8 试剂，37℃ 孵育3 h，于波长为 450 nm、参考波长 620 nm 处读出各孔OD 值。 　　2. 6 神经元 LDH 漏出率测定将密度为 1 × 105/ ml 的神经元细胞接种至 96孔板，每组 6 个复孔，经各种小胶质细胞的条件液孵育结束后，向 96 孔板加样孔中加入 10μl/孔的细胞上清液和标准品; 将底物缓冲液与氧化型辅酶I 溶液以 5∶ 1 混合，加入 60 μl / 孔的混合液，37℃水浴 15min; 加入 60μl/孔的 2，4-二硝基苯肼溶液，37℃ 水浴 15min; 加入 150μl/孔的终止液，室温放置 3min 后，用酶标仪在 440nm 波长读取OD 值，并根据标准品进行计算。 　　2. 7 免疫印迹法检测神经元细胞 NMDAR1 和caspase-3 的表达将密度为 1 ×106/ ml 的神经元细胞接种至 6 孔板，每组 3 个复孔，经各种小胶质细胞的条件液孵育结束后，收集各组不同方法处理后的神经元到EP 管中，D-hank's 洗 2 次，加入 RIPA 裂解液，冰上裂解约 20min，4℃ 下 12000r/min 离心 20min，BCA 法蛋白定量，取上清按体积比加入 5 × loadingbuffer，于 95℃ 水中煮沸 5 min。各组统一取蛋白样品 20μg 进行 12. 5% SDS-PAGE 电泳，将蛋白用湿转法转移至 PVDF 膜，经 5% 脱脂牛奶 37℃ 封闭2 h 后，分别加入 1 ∶ 500 稀释的 NMDAR1 一抗和caspase-3 一抗 ( 内参为 1 ∶ 2 000 的 β-actin) 进行4℃ 孵育过夜，TBST 洗膜 5 × 15 min，再与 1 ∶1 000 的羊抗兔二抗 37℃ 孵育 1 h，TBST 洗膜 5 × 15min，在膜上滴加 ECL 发光液后进行曝光、显影定影处理检测阳性信号。 　　2. 8 统计学方法采用 SPSS 10. 0 统计软件进行分析。连续型变量采用 (珋x ± s) 表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，方差齐时两组间均数比较采用 LSD 法，方差不齐时两组间均数比较采用 Tamhane T2法。 　　3 结果 　　3. 1 各组神经元细胞活性及 LDH 漏出率比较表 1 示，与正常对照组比较，氧糖剥夺组和氧糖剥夺条件液组神经元细胞活性明显下降，LDH漏出率明显增加 ( P ＜0. 01) 。与氧糖剥夺组比较，通络救脑条件液组、栀子苷条件液组、人参皂苷Rg1 条件液组神经元细胞活性明显提高，通络救脑条件液组、栀子苷条件液组 LDH 漏出率明显降低( P ＜0. 05 或 P ＜0. 01)【表1】 　　3. 2 各组神经元细胞 NMDAR1 和 caspase-3 表达比较表 2 示，与正常对照组比较，氧糖剥夺组和氧糖剥夺条件液组神经元细胞 NMDAR1 和 caspase-3表达均明显上升 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) 。与氧糖剥夺组比较，通络救脑条件液组、栀子苷条件液组NMDAR1 表达明显下降，通络救脑条件液组、人参皂苷 Rg1 条件液组 caspase-3 表达明显下降( P ＜0. 05 或 P ＜ 0. 01) 。【表2】 　　4 讨论 　　小胶质细胞是脑源性的巨噬细胞，在脑缺血时迅速增加并活化，参与脑缺血的病理生理过程。 　　缺血后神经元的凋亡是神经元死亡的重要形式之一。缺氧状态下的小胶质细胞会大量活化，对神经元产生神经毒作用，从而引起缺血后的神经元凋亡。近年来随着对中风病病因病机认识的深化，中医药对中风病的临床和科研显示出独特的优势。通络救脑注射液中栀子味苦性寒，为气分之血药，清热解毒，通泻三焦之火; 三七味苦性温，具有化瘀止血、活血定痛的作用。二者共奏承制调平、神机复用以维护脑微环境的功效。 　　本研究结果显示，与正常对照组相比，正常条件液组的神经元活性和 LDH 漏出率没有明显的变化，表明对于正常培养的神经元，小胶质细胞对其不发生影响; 而氧糖剥夺条件液组神经元的细胞活性明显下降，漏出率明显增加，其变化程度比单纯受到氧糖剥夺损伤更明显，表明缺氧损伤后的小胶质细胞对神经元产生明显的毒性作用。通络救脑条件液组、栀子苷条件液组、人参皂苷 Rg1 条件液组均可使神经元的活性得到不同程度的恢复，同时降低神经元的 LDH 漏出率。但是栀子苷和人参皂苷 Rg1 两种方式处理后的小胶质细胞条件培养液对神经元的作用侧重点不同，人参皂苷 Rg1 提升神经元活性更明显。而栀子苷降低神经元的 LDH漏出率效果更明显，综合二者使用的通络救脑条件液组可同时提高神经元活性及降低 LDH 漏出率，提示通络救脑注射液处理后的小胶质细胞条件培养液可同时提高神经元的细胞活性和降低 LDH 漏出率，显示了配伍使用的整体作用。 　　各种原因引起的脑缺血缺氧，其受损局部组织的神经元可释放大量的兴奋性氨基酸 ( EAA) ，主要是谷氨酸 ( Glu) ，致使细胞间隙的 EAA 浓度很快增加，而细胞间隙中超常量的 EAA 持续强烈地作用于细胞膜上的 Glu 受体亚型---NMDAR，触发一系列 Ca2 +依赖性反应，造成神经元进一步损伤，因此认为在缺血性脑损伤中 NMDAR 发挥着关键作用。在脑缺血再灌注损伤的病理过程中，神经元凋亡起着关键性作用，通过多种通路转导凋亡信号，进而激活 caspase 家族，诱导细胞凋亡，其中 caspase-3 是 caspase 级联瀑布下游最关键的凋亡蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用。本研究中氧糖剥夺条件液组神经元NMDAR1 和 caspase-3 表达亦发生明显的上调，说明缺氧的小胶质细胞对神经元产生损伤及诱导凋亡的作用。栀子苷条件液组、人参皂苷 Rg1 条件液组可分别降低神经元的 NMDAR1 和 caspase-3 表达，说明栀子苷和人参皂苷 Rg1 发挥作用有不同的侧重点。通络救脑条件液组可同时降低神经元NMDAR1 和 caspase-3 的表达，提示栀子苷有抑制受损神经元 NMDAR 的表达的作用，而人参皂苷Rg1 有 抑 制 神 经 元 凋 亡 的 作 用， 表 现 为 降 低caspase-3 的表达，推测通络救脑注射液整体上明显优于两个有效成分，显示了中药组方配伍发挥整合调节的治疗优势。通络救脑注射液及其单体成分可通过调节小胶质细胞的分泌成分，逆转损伤小胶质细胞可能对神经元造成的影响，通过神经元周围微环境的改变，而发挥神经元的保护作用。 　　参考文献 　　［1］Tremblay ME，Lowery RL，Majewska AK. Microglial in-teractions with synapses are modulated by visual experience［J］. PLoS Biol，2010，8( 11) : e1000527. 　　［2］李澎涛，王永炎，黄启福 .“毒损脑络”病机假说的形成及其理论与实践意义［J］. 北京中医药大学学报，2001，24( 1) : 1-6.