术后化疗的Ⅱ期结肠癌患者血清Smad4的表达及临床意义

术后化疗的Ⅱ期结肠癌患者血清Smad4的达及临床意义 　　Smads家族蛋白在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，且不同的Smad介导不同的TGF-β家族成员的信号转导。TGF-β作为配体形成的受体复合物，激活Smads进入核内，共同激活或抑制它们调节的靶基因的转录。Smad是某些基因的转录激活因子，例如活性Smad(白细胞抑制因子)启动子近端的Smad-binding element(Smad结合元件，SBE)结合。当Smad4或Smad2/3被siRNA干扰时，TGF-β诱导LIF表达的作用下降了。Smad2或3只敲除一个，则LIF表达量仍较高。 　　摘要：目的 研究Ⅱ期结肠癌患者术后行辅助化疗前后血清Smad4表达水平及临床意义。方法 110例Ⅱ期结肠癌术后辅助化疗的患者，根据有无复发情况分为复发组(37例)和未复发组(73例);应用酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)对其辅助化疗前后血清Smad4水平进行检测。分析血清Smad4水平与患者无病生存时间的关系。结果 未复发组化疗后血清Smad4水平与化疗前相比明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);复发组化疗前血清Smad4显著低于未复发组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。患者血清Smad4水平与患者无病生存期呈正相关(I=-2.03，P<0.05)。结论 血清Smad4水平变化可作为评测Ⅱ期结肠癌患者术后辅助化疗疗效及预后的重要分子生物学指标。 　　关键词：血清Smad4 ;化疗;酶联免疫吸附剂测定法;结肠癌 　　结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其易复发和转移的特性严重威胁着人类的健康和生命[1]。Ⅱ期结肠癌最为多见，手术治疗是其公认的治疗手段，而辅助化疗也越来越普遍，但是辅助化疗的效果却存在争议。因此，寻找能早期预测化疗疗效的分子生物学指标非常重要。Smad4基因是转化生长因子-β(TGF-β) 信号通路的重要级联分子，在信号转导、调节靶基因的转录过程中发挥着重要的作用[2]。作者之前的研究表明Smad4在结肠癌的发生发展中起着非常重要的作用，参与了肿瘤新生淋巴管的生成，促进了肿瘤的转移[3]。本研究进一步探讨血清Smad4水平变化在Ⅱ期结肠癌患者术后化疗中的临床意义。现报告如下。 　　一、资料与方法 　　1. 1 一般资料 选取沧州市中心医院 2013年5月～2015年8月经病理和临床指标诊断为Ⅱ期结肠癌患者110例，平均年龄(68±10)岁，平均随访时间为60个月。其中未复发者(未复发组)73例，复发者(复发组)37例。所有患者均行结肠癌根治术，术后行静脉化疗，化疗：四氢叶酸200 mg/m2，5-氟尿嘧425 mg/m2连续5 d，28 d为1个周期，共化疗6周期。所有患者术前均未接受化疗、放疗及免疫治疗等抗肿瘤治疗。 　　两组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。 　　1. 2 血清Smad4的检测方法 　　1. 2. 1 建立标准曲线 利用棋盘滴定法确定抗原、抗体最适工作浓度。采用间接ELlSA法检测不同浓度标准品的吸光度值，以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，建立标准曲线。 　　1. 2. 2 血清Smad4检测 早晨空腹抽取静脉血3 ml 25℃条件下静置1 h，10000 r/min高速离心10 min，取上清血浆1 ml，加入1.5 ml试管中，置入-65℃冰箱保存。待所有血液样品处理完之后统一采用ELISA检测Smad4蛋白浓度，实验严格按照Smad4蛋白(ELISA)试剂盒操作。 　　1. 3 随访 所有患者均采用电话随访、门诊复查和住院等相结合的随访方式。 　　1. 4 统计学方法 采用Curve Expert1.30曲线软件绘制标准曲线。采用SPSS20.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示，采用t检验;计数资料以率(%)表示，采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。 　　二、结果 　　2. 1 两组患者化疗前血清Smad4水平变化比较 复发组化疗前血清Smad4水平为(36.5±8.7)pg/ml，而未复发组中化疗前血清Smad4水平为(75.4±12.7)pg/ml，两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1。 　　2. 2 两组患者化疗前后血清Smad4水平变化比较 复发组术化疗后Smad4水平为(40.2±11.5)pg/ml，与化疗前Smad4水平相比差异无统计学意义(P>0.05)。而未复发组化疗后Smad4水平为(99.3±21.5)pg/ml，显著高于于化疗前水平，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图2。 　　2. 3 化疗前血清Smad4与患者无病生存时间的关系 患者化疗前血清Smad4的水平与其无病生存期呈正相关 (I=-2.03，P<0.05)。患者化疗前血清Smad4水平越高，其无病生存时间越长;Smad4 阳性表达组的无病生存时间明显的长于Smad4阴性表达组，两组差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。 　　三、讨论 　　结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。多种治疗手段，如手术治疗、化疗和靶向治疗，使Ⅱ期结肠癌的治愈率已明显提高，但化疗后仍有部分患者出现肿瘤的复发和转移[4]。因此，寻找能早期预测化疗疗效的分子生物学指标非常重要。目前，Ⅱ期结肠癌患者的最主要化疗方案还是以5-氟尿嘧为基础的化疗。Smad蛋白被证实是TGF-β家族的下游信号蛋白，在信号转导、调节靶基因的转录过程中发挥着重要的作用[5]。Smad4蛋白是其重要的成员之一，其位于人染色体18q21，是首先在胰腺癌中发现的新型抑癌基因[6]，其所编码的Smad4蛋白是转化生长因子-β(TGF-β)信号通路的重要级联分子，在信号转导、调节靶基因的转录过程中发挥着重要的作用[7]。国外多项研究报道，在胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌中，Smad4基因的缺失与失活可以增加肿瘤细胞的侵袭与转移能力，从而导致肿瘤的转移复发[8]。Papageorgis等[2]经体外实验证实Smad4基因失活能与结肠癌细胞的化疗耐药有密切关系，Smad4可能在结肠癌的发生发展中发挥着重要的作用。因此，本研究选取110例Ⅱ期结肠癌术后行以5-氟尿嘧为基础的辅助化疗的患者，对其化疗前后的血清中Smad4水平进行检测，探讨其在其化疗中的意义及其与无病生存时间的关系。 　　研究结果发现，复发组化疗前血清中Smad4水平明显的低于未复发组(P<0.05);复发组化疗前后血清中Smad4水平变化不显著;但是未复发组化疗后血清中Smad4水平与化疗前血清Smad4水平相比，明显升高(P<0.05);这说明在在结肠癌患者中Smad4发挥了抑制肿瘤复发转移的作用，这与之前的研究结果是一致的[9];同时也说明血清中Smad4的水平可以预测Ⅱ期结肠癌术后对以5-氟尿嘧为基础的辅助化疗的疗效和敏感性的预测，高水平的Smad4的Ⅱ期结肠癌术后患者对以5-氟尿嘧为基础的辅助化疗有良好的疗效，复发转移的几率也明显降低。作者进一步分析了血清中Smad4表达水平与Ⅱ期结肠癌化疗后的无病生存期之间的关系，结果表明，血清中Smad4水平与结肠癌患者化疗后的无病生存时间呈正相关，化疗前血清Smad4水平越高，其无病生存时间越长，Smad4 阳性表达组的无病生存时间明显的长于Smad4阴性表达组。 　　总之，血清中Smad4的水平能预测Ⅱ期结肠癌患者术后对5-氟尿嘧为基础的辅助化疗的敏感性，并与化疗后患者的无病生存时间呈负相关，Smad4在结肠癌的发生发展中发挥着抑制因子的作用。但是，因为本研究样本量有限，还待更大的临床样本来证实，同时，需要更多更深入的具体分子机制的研究。 　　： 　　[1] Siegel R，DeSantis C，Virgo K，et al. Cancer treatment and survivorship statistics，2012. CA Cancer J Clin，2012，62(4)：220-241. 　　[2] Papageorgis P，Cheng K，Ozturk S ，et al. Smad4 in activation Promotes malignancy and drug resistance of colon cancer. Cancer Res，2011，71(3)：998-1008. 　　[3] Liu Y，Sheng J，Dai D，et al. Smad4 acts as tumor suppressor by antagonizing lymphangiogenesis in colorectal cancer. Pathol Res Pract，2015，211(4)：286-292. 　　[4] Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008： GLOBOCAN 2008. Int J Cancer，2010，127(12)： 2893-2917. 　　[5] Annes JP，Munger JS，Rifkin DB. Making sense of latent TGF-β activation. J Cell Sci，2003，116(Pt2)：217-224. 　　[6] Yanagisawa J，Yanagi Y，Masuhiro Y，et al. Convergence of transforming growth factor-beta and vitamin D signaling Pathways on SMAD transcriptional coactivators. Science，1999，283(5406)： 1317-1321. 　　[7] Lagna G，Hata A，Hemmati-Brivanlou A，et al. Partnership between DPC4 and SMADProteins in TGF-beta signalling pathways. Nature，1996，383(6603)： 832-836. 　　[8] Hahn SA，Bartsch D，Schroers A，et al. Mutations of the DPC4/Smad4 gene in biliary tract carcinoma. Cancer Res，1998，58(6)： 1124-1126. 　　[9] Miyaki M，Iijima T，Konishi M，et al. Higher frequency of Smad4 gene mutation in human colorectal cancer with distant metastasis. Oncogene，1999，18(20)：3098-3103.