人脐带间充质干细胞神经分化潜能与方法

人脐带间充质干细胞神经分化潜能与方法 　　研究显示视网膜神经节细胞是最早受损同时也是凋亡率最高的细胞，并且随着DR进展光感受器凋亡率明显增加，下面是搜集的一篇相关，欢迎阅读借鉴。 　　糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)是糖尿病最为常见的微血管并发症之一，在微血管系统病变前已出现神经组织的慢性退行性变，包括神经元凋亡和反应性神经胶质细胞增生等[1].探讨DR神经损伤机制以阻止其发生发展是目前眼科研究的前沿与焦点[2].间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)是来源于胚胎中胚层的一类成体干细胞，具有向多胚层细胞分化，向组织损伤部位定向迁移并促进损伤修复、免疫抑制、抗炎以及神经营养等功能[3].MSC不仅来源丰富，还具有较强增殖、分化及免疫调节能力，其分泌的各种细胞因子能够抑制细胞的凋亡，促进神经修复及加强神经稳定[4].为此，本文采用取材方便、具有多向分化潜能的人脐带组织中分离的MSC(UC-MSC),对其进行传代培养和性质鉴定，并探讨其神经分化潜能及神经分化的有效方法，以期为将来应用UC-MSC临床治疗DR神经损伤提供理论基础。 　　资料与方法 　　一、实验方法 　　1.UC-MSC的分离培养：取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，以PBS充分冲洗，剔除脐动、静脉，剩余的间质组织切割成直径约1~2mm大小的组织块。细胞培养液DMEM培养基和N2/B27培养基(美国GIBCO公司)用重蒸水配制，过滤消毒，加入100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素抗菌，在DMEM中加入10%FBS、EGF(5ng/m1)、bFGF(5ng/m1)、25mM谷氨酰胺等。将处理的脐带组织块置于配制的含10%的FBS的细胞培养液中，在6孔板中于含有5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养，新生细胞呈贴壁生长，待细胞生长至融合时传代。用0.25%的胰蛋白酶(含1mmol/L的EDTA)消化3~5min,离心弃上清，细胞稀释4-5倍继续培养，以相差显微镜观察并拍照。 　　二、UC-MSC的鉴定 　　1.采用流式细胞仪对MSC表面特异性抗原进行检测，鉴定细胞的生物学特性。细胞达80%汇合后，以0.2%的胰酶/EDTA消化并按1:2~1:3的比例传代。收集第3代细胞，以2×104个/ml接种于24孔板，隔日取3孔贴壁细胞，将待检细胞样品分为每管0.1ml,加入PE-CD73、FITC-CD105、PE-CD34、PE-CD35、PE-CD19、FITC-CD90、PE-CD11b、FITC-IgG1和PE-IgG1流式抗体一抗(美国Sigma公司),4℃孵育30min,加入荧光标记的二抗，4℃孵育30min,最后用100ml/l甲醛溶液固定细胞，用流式细胞仪(美国BD公司)测定各类抗原的阳性率。 　　2.鉴定MSC体外多向诱导分化潜能。以生长良好的第3代细胞为实验细胞。细胞经消化后调节密度为2×104个/ml,分别接种入12孔培养板和预置盖玻片的6孔培养板，24h后细胞完全贴壁，更换分化诱导培养基并分别设对照组。向成骨细胞诱导分化：以成骨诱导培养基培养(DMEM/F12培养基，100ml/LFBS,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/L抗坏血酸),每3~4d全量换液1次，培养至第4周时行碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色。向脂肪细胞诱导分化：以成脂肪诱导培养基培养(DMEM/F12培养基，100ml/lFBS、地塞米松1μmol/l、胰岛素5μ/ml、吲哚美辛0.5μmol/l),每3~4d全量换液1次，培养至第21天时作油红"O"染色。 　　三、UC-MSC诱导神经分化培养 　　1.向神经干细胞诱导分化培养：取第5代UC-MSC,以2×104个/ml接种于24孔板上，进行诱导分化。在细胞贴壁生长达到60%~70%密度时，更换培养液，加入诱导培养基诱导。诱导培养体系为含2%N2/B27,100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的无血清neurobasal培养基，EGF(5ng/m1)和bFGF(5ng/m1).置37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中培养18~20d.每3d添加诱导因子1次，每7d换液1次，观测细胞形态改变。 　　2.向神经元细胞诱导分化培养：取第5代UC-MSC,以2×104个/ml接种于24孔板上，进行诱导分化。在细胞贴壁生长达到60%~70%密度时，更换培养液，加入诱导培养基诱导。诱导培养体系为DF12添加EGF(10ng/m1)和bFGF(10ng/m1)、10μMForskolin、0.5μM全反式维甲酸、0.1mMIBMX、10ng/mlBNDF以及5%胎牛血清。置37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中培养7d.每3d换液1次，观测细胞形态改变。 　　四、免疫细胞化学检查 　　用Nestin、NeuroD1、MAP2、NF-M单克隆抗体对诱导的神经细胞进行免疫组织化学染色。神经干细胞诱导后，以4%的多聚甲醛固定，正常兔血清封闭，加入一抗NES(1:150)或NeuroD1(1:100)于4℃孵育过夜，PBS洗涤后加入FITC标记的兔抗小鼠或羊抗兔二抗于室温孵育30min,Olympus荧光显微镜观察、计数并拍照。神经元细胞诱导后，以4%的多聚甲醛固定，正常兔血清封闭，加入一抗MAP2(1:150)或NF-M(1:100)于4℃孵育过夜，PBS洗涤后加入FITC标记的兔抗小鼠或羊抗兔二抗于室温孵育30min,Olympus荧光显微镜观察、计数并拍照。 　　五、RT-PCR检测 　　取5×106个/ml诱导分化后的神经细胞，以Tr-izol常规提取总RNA.逆转录反应为40μl体系，含2μg总RNA、25μg/ml的随机引物、0.5mMdNTP、1.5mMMgCl2、10mMDTT、1×buffer和2μlRNA酶抑制剂和2μlM-MLV,PCR仪扩增35个循环。引物由宝生物有限公司合成。正反引物及扩增产物的长度如下：β-actin引物F:5'-CATGGGTCAGAAGGATTCCT-3',R:5'-TGATCTGGGTCATCTTCTCG-3'(396bp)退火温度53℃.Nestin引物F:5'-AGCTGGCGCACCTCAAGATG-3';R:5'-AGGGAAGTTGGGCTCAGGAC-3'(495bp),退火温度53℃;Neurod1引物F:5'-CGCTGGAGCCCTTCTTTGAA-3';R:5'-GCGGACGGTTCGTGTTTGAA-3';MAP2引物F:5'-AATCAGCTCTGGCTCCCAGT-3';R:5'-AGTGGGTGTTGAGGTACCAC-3'(342bp),退火温度52℃;NF-M引物F:5'-GAGGCGGCCAGTTATCAGGA-3';R:5'-GTTCTCCTCGCCCTCTAGCA-3'(168bp),退火温度52℃.扩增产物用1.0%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳显影，照相结果。半定量标准依据内参照β-actin. 　　六、统计学分析方法 　　采用SPSS10.0软件进行统计学分析，计量数据以x±s表示。组间阳性细胞数(FITC)计算阳性细胞百分比比较，采用单因素方差分析法，组间各指标的多重比较采用最小显着差法(LSD)t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。 　　结果 　　一、UC-MSC的原代培养 　　UC-MSC呈贴壁生长，倒置显微镜可见细胞呈形态相对均一的梭形细胞，呈放射状排列生长或旋涡状生长(图1A~C).细胞贴壁生长至80-90%融合时可根据需求按照1:2~1:3的比例进行传代。本实验所用的UC-MSC为P4~P6,细胞在传代过程中保持形态和基本生物学特性不变。 　　二、UC-MSC的鉴定 　　培养第5代的UC-MSC用流式细胞仪检测相关的细胞表面标记，见表1.结果显示细胞均表达CD105(SH2)、CD73(SH3)和CD90,阳性率不低于95%;不表达CD34、CD45、CD11b和CD19,阳性率不高于2%.对组织相容性免疫表型的分析显示UC-MSC不表达HLA-DR(HLA-II)抗原。 　　UC-MSC在更换成骨培养基后，观察发现细胞增殖能力减慢，形态逐渐变为多角形或不规则形，部分细胞呈现长梭形。诱导约1周左右，细胞间隙逐渐变小，可观察到骨钙沉淀，茜素红染色呈阳性(图2A).UC-MSC在成脂培养条件下，细胞生长速度明显减慢。诱导约1周左右，多数细胞的形态较前变肥大、扁平，可观察到到细胞内细小的脂滴，显微镜下为圆形透亮结构，脂滴可逐渐变大、增多，红油"O"染色呈红色(图2B)。 　　三、UC-MSC向神经干细胞诱导分化 　　与未诱导的UC-MSC相比，大部分细胞在含有bFGF和EGF的诱导培养基后体积变小。诱导培养3~4d时，60%~70%细胞开始聚集形成大小不等的细胞簇，仍有小部分细胞贴壁生长(图3A).随着细胞簇逐渐变大，逐渐脱离培养瓶底形成悬浮的细胞团，类似于直接从发育中或是成体中枢神经系统中分离培养获得的典型的神经球，形状较规则，折光性强(图3B).细胞团生长迅速。培养约18-20天时，可见大小不等的神经球样细胞团(图3C). 　　RT-PCR结果显示，与未诱导的UC-MSC相比，定向诱导后获得的UC-NSC(诱导的神经干细胞)表达神经干细胞标志NES和NeuroD1(图4A).诱导培养20d后，免疫荧光染色结果显示诱导获得的UC-NSC高表达神经干细胞的特异性标志，Nestin和NeuroD1的表达量分别为(87.3±14.7)%和(72.6±11.8)%(图4B-C).实验结果说明在上述诱导条件下获得的细胞具有神经干细胞的特点。 　　四、UC-MSC向神经元细胞诱导分化 　　与未诱导的UC-MSC相比，大部分细胞向神经元细胞诱导培养72h后，可观察大部分细胞体积减小，有神经元样的突起，细胞胞体饱满、折光性明显变强。 　　RT-PCR结果显示，与未诱导的UC-MSC相比，定向诱导后获得的Neuron表达神经元细胞标志MAP2和NF-M(图6A).诱导培养7天后，免疫荧光染色结果显示诱导获得的Neuron高表达神经元细胞的特异性标志，MAP2和NF-M的表达量分别为43.1±10.3%和69.4±19.5%(图6B-C).实验结果说明诱导后细胞表达神经元特异性标志物。 　　讨论DR的神经损伤最早由BarberAJ等[5]提出，研究显示视网膜神经节细胞是最早受损同时也是凋亡率最高的细胞，并且随着DR进展光感受器凋亡率明显增加[6].但目前尚无有效的促进DR神经损伤后神经修复措施，而外源性细胞替代治疗是神经修复重建的最有前途的治疗策略[7].近年来，多项研究报道了MSC体外特定条件下能转化为神经元样细胞，使MSC受到了越来越多的关注[8,9].MSC是一类具有显着的自我更新和多向分化能力的细胞，其来源丰富，主要包括骨髓、脐血、脐带、全身结缔组织和器官间质[10].目前MSC主要来源于骨髓，但骨髓中MSC含量低，且供者MSC的采集须行骨髓穿刺术，其来源受到限制[11].脐血MSC来源充足但MSC分离效率低，限制了其在组织工程和细胞治疗中的广泛应用[12].因此，有必要寻求新的组织工程种子细胞来源。有学者发现，脐带来源的MSC有与骨髓MSC相似的特性[13].Leong等[14]研究发现，脐带MSC具有多能干细胞的潜能，可以在体外培养能增殖20代以上，用神经诱导因子处理，脐带MSC可表达神经标记。JoyceN等[15]将脐带MSC移植到大脑后，发现MSC不仅存活、移行，而且表达神经细胞的标记，证明脐带MSC具有干细胞功能，并能向神经细胞分化。 　　目前，在体外从脐带分离获得MSC方法主要有酶消化法和组织块培养法，前者MSC单层形成时间早，约7d左右，但成本较高;后者MSC单层形成时间较晚，约12d左右，但成本较低[16].本研究中，我们以组织块培养法成功地分离出脐带MSC.结果表明，此方法不仅简便易行，可更好地保持细胞活力并减少了污染机会。此外，在培养体系中，几乎见不到造血、内皮或平滑肌等细胞的混杂。目前尚未明确MSC的特异性抗原标志，通常以细胞形态、流式细胞检测结果、多向分化潜能作为判断标准[17]. 　　本研究分离纯化得到的脐带间充质干细胞具有贴壁生长的特性，形态类似成纤维细胞，流式细胞仪检测MSC高表达CD105(SH2)、CD73(SH3)及CD90,不表达造血系标志CD34、CD45、CD11b和人白细胞抗原HLA-DR.经成骨和成脂诱导培养基诱导后，通过茜素红染色证实分化为成骨细胞，通过油红"O"染色证实分化为脂肪细胞。因此，我们从人脐带中获取的这些细胞即是间充质干细胞。 　　本研究利用神经营养因子诱导法从MSC中诱导出神经细胞，细胞形态发生改变，胞浆收缩，形成大小不等的神经球样细胞团。经免疫组化染色及RT-PCR法证实，未经诱导的MSC不表达神经元细胞标志MAP2,神经干细胞标志NSE的阳性细胞亦十分少见，且表达水平很低。但经神经分化诱导，大部分细胞发生明显的形态改变，并开始表达神经元特异性标志NSE,这不仅表明了脐带MSC具有良好的可塑性，而且使得在较短时间内提供足够临床应用的神经元样细胞成为可能，为临床应用奠定基础。 　　国外有学者证实MSC经不同的诱导方法可变为神经样细胞，并分别表达神经干细胞标志物nestin、成熟神经细胞标志物NSE、NF-M及胶质细胞特异性标志物GFAP、GalC[18].Munoz等[19]研究显示，首次传代后的MSC即已有80%细胞表达Nestin及NeuroD1.P4-P5后，可检测到低度表达的成熟神经元标志物MAP2、及GFAP.本实验亦证实诱导后均有NSE、MAP2、NF-M及其mRNA表达，且诱导后表达明显增加，与文献报道一致[20],但关于这一特异性转化的机制尚有待于证实。 　　结语 　　总之，本研究证实了人脐带富含MSC,且可在体外进行分离、培养、扩增传代，在一定条件下可分化为神经样细胞。并且脐带易于获得，MSC含量丰富，增殖能力好，在DR神经损伤修复方面有着广阔应用前景，神经保护治疗将成为改善DR患者生存质量的一项重要策略。但MSC针对DR治疗后的远期效果还需观察和探讨，其安全性和有效性还有待进一步评估。