死亡受体DR4基因多态性与溃疡性结肠炎易感性的关系

死亡受体DR4基因多态性与溃疡性结肠炎易感性的关系　　[摘要]目的探讨死亡受体(DR)4基因多态性与溃疡性结肠炎(UC)易感性及其临床病理特征的关系。在147例UC患者和244名健康对照者中，采用直接测序法检测DR4(rs20575)基因单核苷酸多态性。采用非条件Logistic回归DR4(rs20575)基因多态性与UC的关系。结果与对照组比较，UC组DR4(rs20575)突变等位基因(G)和基因型(CG+GG)的频率明显升高(5.78%vs1.23%，P=0.001，OR=4.930，95%CI：1.192～12.651;7.48%vs2.46%，P=0.025，OR=3.208，95%CI：1.161～8.869)。根据改良的Truelove&Witts严重程度分型标准将UC患者分为轻度、中度和重度。结果显示中重度UC患者中DR4(rs20575)突变等位基因(G)和基因型(CG+GG)的频率显著高于轻度患者(10.64%vs3.50%，P=0.020，OR=3.282，95%CI：1.208～8.916;14.89%vs4.00%，P=0.028，OR=4.200，95%CI：1.165～15.146)。DR4(rs20575)的突变等位基因和基因型频率在广泛性结肠炎和远端结肠炎之间均无统计学差异(P>0.05)。结论DR4(rs20575)基因多态性与UC易感性密切相关，且可能影响UC的病情严重程度。　　[关键词]基因多态性;死亡受体;溃疡性结肠炎　　溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)是一种病因不明的直肠和结肠慢性非特异性的炎症性疾病，病变只局限于大肠黏膜和黏膜下层。临床主要现为黏液脓血便、腹痛、腹泻、里急后重、体重减轻和贫血等。据流行病学研究报道，我国UC的发病率约为11.6/100000，并呈逐年上升趋势[1]。目前认为肠上皮细胞及免疫细胞的凋亡缺陷可能是引起肠组织中异常免疫应答、导致炎症反应失控的关键环节[2]。　　死亡受体(deathreceptor，DR)4是肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL)的功能性受体之一，它与TRAIL结合后，能产生促靶细胞凋亡信号，不仅参与机体的免疫调节、免疫监视，还在多种自身免疫性疾病中发挥重要作用。现有研究证实DR4/TRAIL凋亡信号能影响多种疾病的发生和发展，尤其是肿瘤和自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮[3]、多发性硬化[4]、类风湿性关节炎[5]等。据报道DR4介导的生物学功能除受自身蛋白功能和表达的影响外，还与其遗传多态性密切相关。DR4基因位于染色体8p21-22，该区域存在多个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位点，其中DR4(rs20575)是亚洲人群中常见的功能性位点[6-10]。至今国内外有关DR4基因多态性与UC的研究报道少见，因此本研究将在中国汉族人群中探讨DR4(rs20575)基因多态性与UC的关系，旨在为深入阐明UC的遗传免疫学发病机制提供理论依据。　　1、对象与方法　　1.1研究对象　　选择2004年10月～2014年5月我院收集的住院或门诊确诊的UC患者147例，其中男75例，女72例，平均年龄(40.06±13.84)岁。根据2012年中华医学会发表的《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》，经过组织病理学、临床表现、实验室检查、电子结肠镜、影像学检查等综合确立UC诊断。根据蒙特利尔分类标准将UC患者分为广泛结肠炎和远端结肠炎。采用Truelove&Witts分型标准将UC患者分为轻度、中度和重度。对照组均来自泰顺县人民医院体检中心收集的健康体检者，共244例，其中男130例，女114例，平均年龄(41.12±14.76)岁。所有研究对象在纳入实验前均经各项临床检查排除肿瘤、感染性疾病及系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。所有研究对象均为无血缘关系的汉族人群，纳入实验前均签署知情同意书。本研究取得本院伦理委员会的批准。　　1.2研究方法　　1.2.1全基因组DNA提取所有研究的对象均抽取空腹外周静脉血约5mL，置于乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2)抗凝管中，采用Promega公司生产的试剂盒提取全血基因组DNA，后者稀释至10ng/μL后置于-20℃冻存。　　1.2.2直接测序法检测DR4(rs20575)基因多态性①引物设计：DR4(rs20575)的引物由Primer6.0软件设计，由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。其引物序列如下：(F：5’GGGCTGATAGATACGGGTACAAGGA3’;R：5’ACCACGACCAGGAACACAGCAT3’)，②PCR扩增及纯化：PCR总反应体系10μL，包括1μL全基因组DNA，0.5UFastTaq酶(Roche公司)，1μLdNTP(Promega公司)，1μL的10×PCR缓冲液及适量无核酸酶去离子水。循环条件为95℃5min;95℃30s，65℃1min，72℃1min，共35个循环;72℃10min，4℃保存。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取2μLPCR产物，加入1.5U虾碱性磷酸酶(SAP)和2U外切酶(ExonI)，扩容至7.4μL，置于37℃80min，85℃15min，4℃保存。③测序反应以及上机、纯化：测序反应总体系6μL，包括3μLPCR纯化产物，0.4μLBigdye(ABI公司)，1.2μL5×buffer缓冲液，0.4μL正向引物(10μmol/L)和适量去离子水。循环条件：96℃1min，96℃10s，52℃5s，60℃4min，共25个循环。反应产物中加入醋酸钠和无水乙醇混合物并离心，最后往96孔板中每孔中加入8μLHiDi(甲酰胺，ABI公司)，经ABI3730遗传分析仪平台进行测序分析，获取数据后经GeneMapper4.0软件(ABI公司)分析判读基因型。　　1.3统计学处理　　所有数据均输入SPSS18.0统计学软件包处理。分别用χ2检验和两独立样本的t检验比较组间性别、年龄差异。DR4基因型和等位基因的分布用频数(率)来表示，其中等位基因频数=纯合子基因频数×2+杂合基因频数。采用χ2分析检验DR4基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡检验。经校正年龄、性别后，采用非条件Logistic回归分析比较DR4(rs20575)基因多态性与UC易感性及临床病理特征的关系。P<0.05为差异有统计学意义。　　2、结果　　2.1一般资料　　147例UC患者中，采用蒙特利尔分类，直肠、左半结肠炎(E1+E2)和广泛结肠炎(E3)分别为82例(55.78%)和65例(44.22%);以改良的Truelove&Witts严重程度分型标准[12]为依据，轻度100例(68.03%)，中度31例(21.09%)，重度16例(10.88%);吸烟者57例(38.78%)，不吸烟及已戒烟者90例(61.22%)。治疗上采用柳氮磺吡或5-氨基水杨酸117例(79.59%)，泼尼松51例(34.69%)，抗生素36例(24.49%)，免疫抑制剂2例(1.36%)。UC组与对照组在年龄、性别构成比方面差异无统计学意义(P均>0.05)。