鬼针草滴眼液对去势雄兔干眼症的治疗效果分析

鬼针草滴眼液对去势雄兔干眼症的治疗效果分析 　　干眼症是由于泪液的量或质的异常引起的泪膜不稳定和眼表面损害，严重影响患者视力和生活，且患病率逐年上升，以下是搜集整理的一篇探究鬼针草滴眼液对去势雄兔干眼症治疗效果的，供大家阅读参考。 　　眼部是性激素作用的重要靶器官之一，雄激素、雌激素、孕激素和催乳素受体广泛存在于人、兔和鼠的泪腺、睑板腺及角膜等眼表组织[1],而性激素水平下降，泪膜不稳定、局部炎症反应加重，导致了干眼症的形成。对于雄激素水平下降导致的干眼症患者，目前多以局部对症治疗，而雄激素替代治疗副作用多，患者不易接受。因此，临床寻找一种新的激素替代药物成为了眼科急需解决的问题。鬼针草是一种天然植物雄激素，既可补充人体雄激素不足，也可与细胞表面雄激素受体结合发挥微弱雄激素效应，在雄激素水平下降时可能具有独到效果[2].我们前期已经报道了鬼针草叶水煎液能用于治疗更年期和绝经期女性干眼患者的症状和部分体征[3-4],为了进一步探讨鬼针草滴眼液对此类干眼症效果，首先制作去势雄兔干眼症模型，测定其给药前后基础泪液分泌量和泪液蛋白变化，然后将其用于治疗去势雄兔干眼症的动物试验研究。现如下： 　　1资料和方法 　　1.1鬼针草提取液的制备 　　[5]的方法制定鬼针草有效部位的提取。鬼针草全草20kg,70%乙醇提取2次，第1次加入8倍量，第2次加入6倍量，合并乙醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，将浓缩液真空干燥，粉碎。依次用CHCl3和EtOAc萃取，每次加入6倍量，得到鬼针草提取液。 　　1.2鬼针草滴眼剂的制备 　　以蒸馏水溶解鬼针草提取物，水：提取物质量比为1∶0.1,加入眼润滑剂羧甲基纤维素，浓度控制1.5%,加入NaHCO3以及KCl作为缓冲系统，浓度控制在0.1%以下。此时检测理化特性：pH值、渗透压、比重、表面张力、粘稠度和屈光指数，之后调整鬼针草提取物、眼润滑剂、缓冲系统的含量，使之尽量达到：①pH:7.3~7.8;②渗透压：311~350mOsm;③比重：约等于1;④表面张力：40~50dyn/cm2;⑤粘稠度：略高于水;⑥屈光指数：1.336的标准。最后加入保存剂苯扎溴铵，其浓度控制在0.005%. 　　1.3分组及手术 　　新西兰大白兔48只(2月龄，均为雄性，体重2.0~2.5kg)。裂隙灯显微镜、眼底镜检查眼前节及眼底无异常，SchirmerI试验(SchirmerItest,SIT)≥10mm/5min.由南昌大学动物实验室提供。参照马轶群等的方法[6],将36只雄兔行双侧睾丸切除术(orchiectomized,ORX)。将这36只随机分为3组(每组12只，均为右眼)：对照PBS组(A)、鬼针草滴眼剂组(B)，连续滴眼2月，每日4次。C组12只雄兔手术后不滴眼液，作为阳性对照。另12只雄兔切开阴囊，不切除睾丸，作为阴性对照，术前肌肉滴注青霉素针200000U,术后连续3d肌肉注射青霉素针200000U,预防感染。分别于术前、术后1周、2周、1月及2月对患者行SIT检查、角膜荧光素染色、泪液蛋白测定及角膜共聚焦显微镜扫描。 　　1.4SIT检测及角膜荧光素染色 　　SIT检查泪液基础分泌情况。取5mm×35mm有刻度的试纸，一端反折5mm,轻轻放入被测眼下结膜囊的中外1/3处，5min后取出滤纸，测量湿长。参照张梅等的标准，以≥10mm/5min为正常[7].每组动物均由同一人检查，每组动物每次检查时间、地点、照明亮度、湿度及温度相同。角膜荧光素染色：将1滴1%荧光素钠滴眼，嘱其瞬目，评分系统参考国家眼科研究临床干眼评分[8],分为4级，0级：无染色;1级：很少的播散性污渍染色;2级：中度污渍染色，程度在1~3级间;3级：重度融合性污渍染色。 　　1.5泪液蛋白测定 　　所有的泪液样品在9点到11点收集，毛细吸管吸取患者下泪河约20μl非刺激性泪液，用0.5mlEP管保存，置于-80℃冰箱中。以小牛血清白蛋白为标准，Brandford泪液总蛋白含量。淀粉酶活性[9]:使用ethylidene-4-nitrophenyl-α-d-maltoheptaoside(LeadmanGroupCo,Ltd.,Beijing,China)作为底物。 　　检测处的双色读数在405nm和546nm采用自动生化分析仪分析(LX20;Beckman,Fullerton,CA);乳铁蛋白测定采用放射免疫分析法[10]:取泪液样品10μl,生理盐水1∶100稀释，制作标准曲线后计算出乳铁蛋白含量。溶菌酶含量采用试管比浊法测定，溶菌酶测试盒、染色菌液制备、溶菌酶标准液配制及标准曲线的绘制均按说明进行;将泪液及染色菌液混匀，离心后取上清液，根据测定管与样品对照管光密度差值，查标准曲线后得出样品中溶菌酶含量。 　　1.6共聚焦显微镜检查 　　采用Confoscan4裂隙扫描共聚焦显微镜(NidekCo.LTD,日本)检查，操作步骤参考文献[11]:待检兔眼表麻后，将兔头部固定在显微镜前，双眼固视正前方，检查者移动镜头使共焦显微镜与角膜上皮细胞时，将镜头缓慢向前推进，于中央角膜处进行全层扫描，结束后选择有价值的图像与录像存盘，并计算角膜上皮基底细胞及炎症细胞密度。 　　1.7统计学方法 　　采用GraphPadPrism4.00统计软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，计数资料用χ2检验，检验水准均为α=0.05;各组治疗前后及两组间同一时间点的均数比较采用单向方差分析student-t检验及Dunnett检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 　　2结果 　　2.1治疗前后及两组间各项干眼检测指标评定结果比较 　　治疗前A、B两组SIT相比，差异无统计学意义(tSIT=0.853,P>0.05);治疗2月后，B组SIT较治疗前均有不同程度改善，差异有统计学意义(tB1wk=5.753,tB2wk=6.096,tB1mo=7.835,tB2mo=10.732,P<0.05)，而A组SIT较治疗前明显恶化，差异有统计学意义(tA1wk=3.268,tA2wk=4.637,tA1mo=5.532,tA2mo=6.574,P<0.05);A、B两组各时间点SIT相比，差异均有统计学意义(t1wk=3.762,t2wk11mo=7.625,t2mo=12.064,P<0.05,详见表1. 　　治疗前A、B两组荧光素染色评分相比，差异无统计学意义(tFL=0.732,P>0.05);治疗2月后，B组荧光素染色评分较治疗前均有不同程度改善，差异有统计学意义(tB1wk=3.126,tB2wk=2.514,tB1mo=4.335,tB2mo=5.587,P<0.05)，而A组荧光素染色评分较治疗前明显恶化，差异有统计学意义(tA1wk=3.221,tA2wk=4.674,tA1mo=6.631,tA2mo=8.159,P<0.05);A、B两组治疗后2周，1月，2月荧光素染色评分相比，差异均有统计学意义(t1wk=1.329,t2wk=4.469,t1mo=6.663,t2mo=9.597,P<0.05)。见表2. 　　2.2两组用药前后各时间点泪液蛋白比较 　　治疗前A、B两组泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比较，差异无统计学意义(ttotalproteins=10.476,tlysozyme=7.965,tlactoferrin=7.842,tamylaseactivity=5.224,P>0.05);治疗2月后，A、B组泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性与治疗前相比差异有统计学意义(tA1wk=0.167,tA2wk=0.638,tA1mo=0.535,tA2mo=0.783;tB2wk=0.539,tB1mo=0.694,tB2mo=1.015,P<0.05);A、B两组各时间点泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比，差异均有统计学意义(t1wk=0.153,t2wk=0.226,t1mo=0.217,t2mo=0.159,P<0.05)。见表3. 　　2.3治疗前后及两组间共聚焦显微镜结果 　　正常角膜上皮基底细胞显示为光暗细胞体，窄的细胞边界(附图A)。制作去势雄兔2月的干眼症模型后，角膜上皮基底细胞体积缩小，可见有呈亮光样的炎性细胞浸润(附图B)。经过鬼针草滴眼剂处理2月的B组在上皮基底层可见极少数的炎性细胞浸润，但与正常雄兔基底细胞比较，密度稍有降低(附图D)，而经过PBS处理的A组在上皮基底层可见有大量的呈亮光样炎性细胞，上皮基底细胞密度明显增加(附图C)。炎症细胞进行计数发现，经过治疗2月后，A组上皮基底细胞和炎症细胞密度分别为(4084±492)cells/mm2和(324±116)cells/mm2,而B组上皮基底细胞和炎症细胞密度分别为(312和(44±26)cells/mm2,两组比较，差异均有统计学意义(tBC=5.642,tIC=10.467,P<0.05)。见附图E、F. 　　3讨论 　　我国干眼症的发病率逐渐升高并向低龄化发展，而雄激素失调是干眼症主要发病机制之一，它可调节机体及局部的免疫功能，调控泪腺和睑板腺的形态、发育、分化及分泌功能;且对眼的泪液稳定、炎症反应以及细胞凋亡有重要的调节作用。由绝经、衰老、自身免疫性疾病、服用抗雄激素药物等原因引起的雄激素水平下降时，均可导致泪膜不稳定、局部炎症反应和泪腺等腺体组织细胞凋亡加重，最终导致干眼症。 　　眼是性激素作用的靶器官，已证实雄激素、雌激素、孕激素和催乳素受体广泛存在于人、兔和鼠的泪腺、睑板腺、角膜等眼表组织中，雄激素替代药物的意义在于与雄激素受体结合而发挥生物学效应。有研究表明体内睾酮水平与泪液分泌量之间呈正相关[12].此外，雄激素缺乏可促进Sogren综合征的进展，并与泪腺炎症、睑板腺功能异常和重症干眼症有关[13].而雄激素替代疗法是目前此类干眼唯一的对因治疗方法，但长期雄激素应用会造成男性前列腺肥大甚至肿瘤、女性男性化等严重副作用，给患者带来了长期的苦恼。因此，寻找一种行之有效的雄激素替代药物势在必行。黄酮类物质是细胞膜雄激素受体的刺激物，可以与细胞膜雄激素受体结合发挥生物学效应[14]. 　　鬼针草为一种厥阴肝经的天然中药，能分离出木犀草素、槲皮素、异槲皮苷、金丝桃苷、芦丁等8种黄酮类物质，含总黄酮4.035%,其化学结构与雄激素结构相似，可以与细胞膜雄激素受体结合发挥生物学效应，起到拟雄激素活性作用，从而改善泪腺、睑板腺的分泌情况，减轻全身和眼局部的自身免疫反应，抑制泪腺和角膜的局部细胞凋亡，最终达到治疗干眼症的目的。此外，鬼针草具有抑菌作用，同时含大量胆碱，可引起流泪，防止干眼患者的眼表状态进一步恶化。MCVEY[15]通过对连续大豆异黄酮灌胃鼠检测研究表明，连续灌胃120d后，异黄酮灌胃鼠睾丸和精液中雄激素含量，与对照组比较均有显着的升高。李桥等[16]发现鬼针草可以用于治疗局部滴用阿托品导致的干眼。利用放射性示踪标记的方法研究表明黄酮类物质是细胞膜雄激素受体的刺激物，可以与细胞膜雄激素受体结合发挥生物学效应[17].笔者前期探讨了密蒙花等其他黄酮类植物雄激素在干眼症作用，本实验研究表明鬼针草滴眼液也可明显改善干眼症状，减少了水煎液的全身副作用，适用于胃肠道吸收不良的患者。实验表明，鬼针草滴眼液在用药2月后可明显改善去势雄兔干眼SIT和改变泪液蛋白成分，PBS治疗则改善不明显，可能的原因是SIT反映泪液基础分泌量，泪液蛋白反映泪液的成分，鬼针草滴眼液主要作用机制可能发挥拟雄激素作用，促进眼睑腺体(睑板腺分泌的脂质层成分和泪腺分泌的泪液)分泌，故可明显改善SIT和部分泪液蛋白的结果。 　　此外，笔者在实验中还发现鬼针草能有效减少雄激素失调性干眼症的炎症细胞浸润和角膜上皮基底细胞萎缩。这可能与鬼针草改善泪腺、睑板腺的分泌情况，抑制角膜的局部细胞凋亡相关。 　　综上所述，对于去势雄兔干眼症，鬼针草滴眼液可较快而明显地改善干眼的症状和维持泪液蛋白成分。它是一种安全有效、给药途径简单、副反应少，患者能长期坚持的治疗干眼的方法，具有广泛临床应用及推广价值。进行临床试验并研究其干预机制，探讨其作用的受体、信号传导途径、调节机制和有关在临床方面的应用，可能为探索抗眼部炎症、新生血管病变与变性性眼病的治疗策略提供新的途径。 　　参考文献： 　　[1]刘超，王传富。NFκ-Bp65-NOS2在去势雄兔角膜，结膜和泪腺中的表达及意义[J].眼科研究，2006,24(1)：81. 　　[2]李教社，赵玉英，李秀兰。鬼针草黄酮类化合物的分离和鉴定[J].药学学报，1996,31(11)：849-854. 　　[3]邵毅，余瑶，黄国栋，等。鬼针草治疗绝经期女性中重度干眼症临床初探[J].中国实用眼科杂志，2012,30(7)：805-810. 　　[4]邵毅，余瑶，黄国栋，等。鬼针草叶治疗更年期女性中重度干眼症临床研究[J].中国中药杂志，2012,37(19)：2985-2989. 　　[5]曹园，瞿慧，姚毅，等。鬼针草化学成分的研究[J].中草药，2013,44(24)：3435-3439. 　　[6]马轶群，王传富，刘美光。去势雄兔干眼病模型角膜上皮细胞橱亡及相关基因表达的研究[J].眼科研究，2004,22(3)：286-289. 　　[7]邵毅，余静，余瑶，等。无缝线骨髓间充质干细胞羊膜移植预防角膜缘干细胞缺乏的实验研究[J].眼科新进展，2013,33(11)：1011-1015.