神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究(1)

神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究(1) 【摘要】 目的］观察神经干细胞静脉移植对损伤大鼠脊髓功能的治疗作用。［方法］取孕14～16 d SD胎鼠的脑室下区组织，体外培养后鉴定细胞。制作脊髓全切模型，伤后1周将Brdu标记好的神经干细胞通过尾静脉注射移植到大鼠体内，移植后及8周行皮层体感诱发电位（CSEP）检测和BBB功能评分，并留损伤脊髓处作病理切片及免疫组化染色。［结果］（1）移植后8周BBB评分损伤组、移植组都有所恢复，但都未达到正常水平，移植组恢复较好；（2）模型制作后，CSEP波均消失，细胞移植后8周移植组的波形有不同程度的恢复，但潜伏期延长；（3）移植组大鼠脊髓损伤处存在大量Brdu染色阳性细胞，表明移植的细胞在体内可到达损伤脊髓处并能存活；脊髓损伤部位NF-200及GFAP染色阳性的细胞表明移植的细胞可以分化为具有神经元和胶质细胞特性的细胞。［结论］静脉移植的神经干细胞能到达损伤区代替受损的神经元及神经胶质细胞，使损伤的脊髓功能得到一定程度的恢复。 【关键词】 脊髓损伤； 神经干细胞； 静脉移植； 功能恢复 　　脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后自身的修复能力非常有限，死亡的神经元不能由自身产生的神经元或邻近的神经元来代替。近年来神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的研究改变了这一观点。神经干细胞［1,2］是一类存在于中枢神经系统内具有多向分化能力的细胞，能分化成少突胶质细胞、神经元、星形胶质细胞。人们已经把神经干细胞视为治疗脊髓损伤的理想移植细胞。神经干细胞移植治疗脊髓损伤的途径可分为2种：(1)移植物直接植入脊髓损伤部位，此法可导致局部移植物的高密度存在，有利于局部神经纤维的再生;(2)移植物通过血液循环系统到达损伤部位。有关报道表明神经干细胞可以通过损伤部位的血脑—血脊髓屏障到达损伤部位从而修复损伤［3］。本实验旨在研究神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的疗效，为临床进一步治疗脊髓损伤提供科学依据奠定基础。　　1 与方法　　1.1 免疫组化试剂 　　化学试剂5-溴脱氧尿核苷(Brdu)、小鼠抗Brdu单克隆抗体购于Sigma公司；小鼠抗巢蛋白(nestin)多克隆抗体购于Chemicon公司；小鼠抗胶质细胞酸性蛋白(GFAP)IgG1、小鼠抗神经元丝蛋白(NF-200)IgG1及FITC标记的羊抗IgG1购于武汉博士德公司；亲和素标记的Cy3购于KPL公司；细胞因子EGF、bFGF均购于Pepro Tech EC公司。　　1.2 胎鼠来源的NSCs的制备、培养、分化与鉴定［4］　　1.2.1 取胚龄14～16 d［2，5］SD大鼠胚胎的大脑脑室下区组织并吹打成单个细胞，以1.5×105个细胞／ml种瓶，用DMEM／F12(1：1)(Sigma)无血清培养基培养［内含bFGF20 ng／ml、EGF20 ng／ml、B2720 nl／ml(GibCOBRL)］。每3～4 d换液1次。　　1.2.2 对第2代细胞作免疫组化鉴定 取无血清培养基贴壁分化培养24 h的盖玻片1张，4％多聚甲醛固定30 min。0.25％Triton-100破膜12 min，然后用5％脱脂奶粉封闭特异性抗原，室温孵育30 min，吸干残液滴加1：500小鼠抗大鼠nestin IgG1(I抗)，4℃孵育过夜。第2 d滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG1 Ⅱ抗，室温孵育1 h，然后50％缓冲甘油封气，荧光显微镜下观察并摄像。　　1.2.3 神经干细胞分化鉴定［6］ 神经球经机械吹打后接种到多聚赖氨酸包被的玻片上，培养基换为含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基。分化7 d后，行神经元丝蛋白(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组化实验。荧光显微镜下观察并摄像。　　1.3 脊髓损伤模型的制备　　1.3.1 48只成年Wistar大鼠，体重(250±50)g，雌雄不拘，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。动物腹腔麻醉后，背部剪毛，常规碘酒酒精消毒。沿脊柱正中切开皮肤，分离肌肉，暴露椎骨，用咬骨钳仔细咬去椎板，在T9与T11椎骨平面打开椎管，充分暴露T10节段脊髓背面及两侧，用弯头眼科镊将脊髓轻轻挑起，用眼科剪将脊髓完全剪断，将分离的肌肉缝合封闭椎管缺损，缝合皮肤，制成脊髓损伤模型。　　1.3.2 1周后有45只存活，将模型动物随机分为3组，每组15只：（1）正常组(A组)：仅行切皮、打开椎管，不施行SCI；（2）损伤组(B组)：脊髓全横断损伤；（3）移植组(C组)：在脊髓完全横断后1周移植大鼠NSCs悬液。术后14 d内每天腹腔注射青霉素(1×104 u／100 g)。每天将动物的膀胱人工排空2次，直到动物自身排尿反射恢复。　　1.4 NSCs的静脉移植　　1.4.1 移植前的细胞准备 移植前12 h，在鉴定的第2代前体细胞中加入Brdu溶液(5 μmol／l)标记，37℃、5％CO2孵育。移植前调整细胞浓度为5×104／μl，放入冰中待移植。　　1.4.2 C组伤后1周尾静脉注射移植NSCs悬液，量为100 μl［7］。B组注射等量的生理盐水。　　1.5 BBB功能评分［8］评价大鼠下肢功能