高通量测序检测肺炎婴幼儿抗生素治高通量测序检测肺炎婴幼儿抗生素治
,M中国微生态学杂志2016年5月第28卷第5期 ChinJMicroecola2016,Vol.28No.5 y ·497·
·论 著·
高通量测序检测肺炎婴幼儿抗生素治疗前后肠道菌群变化
黄文献,王和平,王玉蕾,戴文魁,郑跃杰
深圳市儿童医院呼吸内科,广东深圳 518026
摘要:目的 了解抗生素对肺炎婴幼儿肠道菌群多样性和结构的影响。方法 选取5例1岁以内因轻度社区获得性肺炎住院的患儿,收集抗生素治疗前及治疗后第3~5天的粪便标本。利用IlluminaMiSe q测序平台,对细菌的16...
高通量测序检测肺炎婴幼儿抗生素治
,M中国微生态学杂志2016年5月第28卷第5期 ChinJMicroecola2016,Vol.28No.5 y ·497·
·论 著·
高通量测序检测肺炎婴幼儿抗生素治疗前后肠道菌群变化
黄文献,王和平,王玉蕾,戴文魁,郑跃杰
深圳市儿童医院呼吸内科,广东深圳 518026
摘要:目的 了解抗生素对肺炎婴幼儿肠道菌群多样性和结构的影响。方法 选取5例1岁以内因轻度社区获得性肺炎住院的患儿,收集抗生素治疗前及治疗后第3~5天的粪便标本。利用IlluminaMiSe q测序平台,对细菌的16SrRNA基因V3~V4区进行高通量测序,并对测序结果进行生物信息学分析。
结果 抗生素治疗后第3~5天婴幼儿肠道菌群的多样性明显下降。变形菌门的相对丰度在3例婴幼儿的肠道中下降;厚壁菌门的相对丰度在4例婴幼儿的肠道中下降;而拟杆菌门的相对丰度在4例婴幼儿的肠道中上升;厚壁菌门与拟杆菌门的比例下降。肠道内不动杆菌属、喜胆汁菌属、埃格特菌属、肠球菌属、支原体、颤螺菌属、紫单胞菌属、普雷沃菌属和真杆菌属增长1倍以上;奇异菌属、双歧杆菌属、黄杆菌属、乳酸菌属、链球菌属、萨特菌属和韦荣球菌下降超过50%。结论 婴幼儿短期使用抗生素治疗肺炎后,肠道菌群的多样性下降,肠道微生态失衡。关键词:肠道菌群;婴幼儿肺炎;抗生素
)0中图分类号:R300378 文献标志码:A 文章编号:100576X(201654974---/0.13381DOI编码:1.cnki.cm.201605001jj
Htutmicrobiotaihhrouhutseuencinrevealsthechaneof- gggpqgg
neumoniafollowinantibiotictreatmentininfantswith pg
*
,WANG ,WANG,,iiHUANG xlkYuWenianHeneiDAIWenuiZHENG Yuee--p--- jg
*DoRDSCHSGCeartmentesiratoriseases,henzhen hildren′s osital,henzhen,uandon18026,hina f ppy pgg5
iuCorresondinuthor:ZHENG uee,E-ail:yeiezina.omaYmsc-@jpgj
:andstructureofuttheimactofantibioticadministrationonthediversitbstractObectiveostudA T pygyj acuiredmicrobiotaininfantswithneumonia.Methodstoolsecimensof5infantswithmildcommunit S qppy neumoniabeforeandthreetofivedasafterantibiotictreatmentwerecollected.Theseuencesofreions pyqgV3-VonIlluminaMiSese4ofbacterial16SrRNAenewereeneratedwithhihhrouhutseuencint --qggggpqg udecreasedafterantibiotictreatofutmicrobiotawassinificantlencinlatform.Resultshediversit- T qggygpy
,mPFdentinthreetofivedas.Therelativeabundanceofroteobacteriaandirmicutesecreasedbutthatof y//FB)diBFBacteroidetesncreased.Theratioofirmicutesacteroidetes(ecreasedinmostofatients.The p,Merthella,EAcrelativeabundancesofcinetobacter,Bilohila,Clostridium,Enterococcusolasma, ggypp,,scillosira,arabacteroidesrevotellandubacteriumwereincreasedbutthelevelsoftoobium,OPPaEA pp
,S,Siidobacterium,Dorea,Flavobacterium,Fusobacterium,LactobacillustretococcusutterellandBa fp
eillonellaeredecreasedb50%.Conclusion ShortermantibioticexosureininfantswithneumoniaVwt -ypp resultsinsinificantdecreaseinmicrobialdiversitanddsbiosisofutmicrobiota. gyyg :G;;AKewordsutmicrobiotaInfantneumoniantibiotics py
人体内定植的微生物与人类健康密不可分。人
)具有以下重体的肠道菌群(ntestinalmicroflorai
)基金项目:深圳市科技
项目(医疗卫生类)(201303068
,女,硕士,主治医师,从事小作者简介:黄文献(1982-)
:h儿呼吸感染临床工作,E-mailuanwenxian6g26.com@1
,男,博士,主任医师,从事小通信作者:郑跃杰(1963-)
:y儿呼吸研究,E-mailueiezina.com@sj
要作用:参与肠道重要的代谢功能,阻止外来致病
菌在肠道黏膜的定植及刺激全身免疫系统和肠道黏
,膜相关淋巴组织(tassociatedlmhoidtissueu ypg
[]
GALT)的正常发育与成熟1。近年来,越来越多的研究
明肠道菌群与人类的疾病密切相关,对健
]42-
。胎儿的肠道是无菌的,出生后康产生重大影响[
肠道菌群逐渐形成,在2岁时肠道菌群的种类和数量与成人水平相似。婴幼儿肠道菌群的建立受到多
·498·,M中国微生态学杂志2016年5月第28卷第5期 ChinJMicroecola2016,Vol.28No.5 y
种因素影响,包括分娩方式、喂养选择(母乳或配
、早产、抗生素和益生菌的使用等,其中使用方奶)
抗生素会改变肠道菌群的组成,对婴幼儿的健康成
5]
。为了观察婴幼儿期抗生长造成长远的不良影响[
素的使用对肠道菌群结构和多样性的影响,本研究采用高通量测序技术对5例婴幼儿使用抗生素前后的肠道菌群进行了16SrRNA基因测序。1 材料与方法
.1 一般资料 选择2013年9月至2014年3月在1
深圳市儿童医院呼吸科住院的轻度社区获得性肺炎患儿5例,男3例,女2例,年龄2~8个月。均符合
)根据临床表现及影像学检查,肺以下纳入标准:(1
炎的诊断及病情分度符合《儿童社区获得性肺炎管理
][76-
;(》)治疗前2周未接受任何指南(013修订)22
)近2周无腹泻病,入院时抗生素和微生态制剂;(3
)无心、肝、肾、内分泌和血大便常规检查正常;(4
液系统等严重躯体疾病。5例患儿的抗生素使用情况
,见表15例患儿在治疗过程中均无腹泻。
表1 患儿信息及抗生素使用情况
患儿12345
性别男男女男女
年龄8个月2个月8个月2个月8个月
使用的抗生素头孢呋辛阿奇霉素头孢呋辛阿奇霉素头孢呋辛
使用途径静脉注射口服静脉注射口服静脉注射
抗生素使用时间4天3天4天3天5天
TUs并获得初始的OTUs代表序列;然后,利用O
[9])将PCHIME(v4.2.40CR扩增产生的嵌合体U
从Osearch_TUs代表序列中去除;最后,使用ulobal将所有Tas比对回OTUs代表序列,得到gg
[0]
。每个样品在最终的OTUs代表序列11.3.2 物种注释分析 利用此前得到OTUs代表)软件将这些代表序列,通过RDPClassifier(v2.2
[11]
比对进行物序列与数据库Greenene(V201305)g
种注释,置信度阈值设置为0.8,获得每个样品分别在门、纲、目、科、属和种几个分类等级的相对丰度情况,并利用R包中的barlot获得各自的柱p
状图。从纲水平开始,将物种丰度在所有样品均低
。于0.5%的物种合并为Others
1.3.3 物种多样性(lhadiversita py)分析 物种多样性是对单个样品中物种多样性的分析,其中hannon指数以及Simson指数最能反映群落中物Sp
12]
。本分析通过M种丰富度和物种均匀度[othur
[12]
()软件计算样品的Sv1.31.2hannon和Simsonp值,然后采用KruskalallisTest对组间的物种多-W
样性指数进行差异分析检验,并通过R软件
)绘制物种多样性指数的盒形图。(3.1.1v
.3.4 统计学分析 抗生素使用前后肠道菌属的相1
对丰度比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果
.1 抗生素使用前后肠道菌群多样性变化 5例患2
儿使用抗生素前和使用3~5d后肠道菌群多样性的结果见图1。在使用抗生素后,婴幼儿肠道菌群的多样性出现明显减少
。
1.2 粪便标本采集 采集粪便标本两个时间点分别
)未接受抗生素治疗时;(为:(12)抗生素治疗第
3~5天。粪便分次收集,放于粪便收集盒中,
避免尿液、灰尘等污染,选取无污染的部分,粪便
。标本采集后标记患儿姓名,干冰运标本量大于1g
送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。.3 方法 利用IlluminaMiSe1 q测序平台,对细菌的16SrRNA基因V3~V4区进行高通量测序,并对测序结果进行生物信息学分析。该过程委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。.3.1 数据过滤及OTUs(oerationaltaxonomic1 p
,操作分类单元)获取 将测序得到的runitsawdata按照接头序列进行样品拆分;然后,将包含超
、接头污染序列超过1过10个低质量值的reads5bp
、重复的r的readseads过滤掉,获得高质量的clean
data并完成数据过滤。通过reads之间的overlap关系将过滤后的
,并在9eads拼接成Tas7%相似度下利用USEr-g[8])将其聚类为用于物种分类的ARCH(v7.0.1090
注:Shannon指数越高说明样品中的物种越丰富;Simson指数越低p
说明样品中的物种越丰富。
图1 抗生素使用前后肠道菌群的多样性变化
2.2 抗生素使用前后肠道菌群在门水平的变化情况
5例患儿使用抗生素前和使用3~5d后肠道菌群在门水平的变化结果见图2。厚壁菌门的相对丰度在1、2、3和5号患儿的肠道中出现了下降;拟杆菌门的相对丰度在1、3、4和5号患儿的肠道中出现了上升;变形菌门的相对丰度在1、4和5号患儿的
,M中国微生态学杂志2016年5月第28卷第5期 ChinJMicroecola2016,Vol.28No.5 y ·499·
肠道出现了下降。
属名
增长1倍以上)表2 抗生素使用后增加的菌属(
抗生素使用前(相对丰度均值)
0.004%.000%0.000%0.025%0.674%5.000%0.116%0.008%0.005%00.000%
抗生素使用后(相对丰度均值)
0.010%0.034%0.038%0.219%24.780%0.019%0.520%16.330%0.026%0.171%
P值
0.610.350.380.240.170.380.650.480.280.38
不动杆菌属喜胆汁菌属梭菌属埃格特菌属肠球菌属支原体颤螺菌属紫单胞菌属普雷沃菌属真杆菌属
表3 抗生素使用后减少的菌属(降低50%及以上)
属名奇异菌属
:放线菌门;A:抗生素使用前;B:抗生素使用后。Actinobacteria
:拟杆菌门;F:厚壁菌门;F:梭acteroidetesirmicutesusobacteriaB
:变形菌门;T:软壁菌门杆菌门;Proteobacteriaenericutes
双歧杆菌属Dorea
黄杆菌属梭菌属乳酸菌属链球菌属萨特菌属韦荣球菌
抗生素使用前(相对丰度均值)
.019%0.780%02.694%.006%0.023%00.728%15.387%2.716%02.452%
抗生素使用后(相对丰度均值)
0.007%0.173%0.075%0.001%0.003%0.010%5.434%0.001%0.503%
P值
0.660.640.530.380.590.490.0970.500.0014
图2 抗生素使用前后肠道菌群在门水平的变化情况
2.3 抗生素使用前后肠道菌群在属水平的变化情况
5例患儿使用抗生素前和使用3~5d后肠道菌群在属水平的变化结果见图3、表2和表3。不动杆菌属、喜胆汁菌属、梭菌属、埃格特菌属、肠球菌属、支原体、颤螺菌属、紫单胞菌属、普雷沃菌属和真
。奇异菌属、杆菌属相对丰度增长1倍以上(表2)
双歧杆菌属、Dorea、黄杆菌属、梭菌属、乳酸菌属、链球菌属、萨特菌属和韦荣球菌相对丰度下调
)。表3超过50%(
3 讨 论
3.1 抗生素对肺炎婴幼儿肠道菌群多样性的影响
人体肠道中细菌的种类达100~1150种,分属于0
0%以上,7个菌门,其中厚壁菌门和拟杆菌门占9
其他有放线菌门、变形菌门、梭杆菌门、疣微球菌门和蓝细菌门。在宿主遗传性控制下,正常微生物
,这三菌群、机体免疫与营养构成了“微生态三角”
者相互依赖、相互制约达到稳定和平衡的状态。但是,抗生素的使用改变了肠道正常微生物菌群,破坏“微生态三角”平衡,其对健康造成的短期影响包括抗生素相关性腹泻、胃肠道不适、舌炎以及可
13]
。此外,抗生能导致肠道内抗生素耐药菌的发生[
素对肠道菌群及免疫系统的影响会导致日后发生哮
]4511-
。研究显喘、过敏性疾病和肥胖的风险增高[
示,如果在婴幼儿期过早地使用抗生素,对肠道菌群的影响更为突出;这是因为该时期肠道内的共生菌处于次级演替过程,肠道微生态的平衡稳定性16]
。本研究中使用S差[hannon指数和Simson指数p
来反映肠道菌群多样性的变化,发现5例患儿在使用抗生素后肠道菌群的多样性出现明显下降,与国
]1167-
。内外的研究一致[
3.2 抗生素对肺炎婴幼儿肠道菌群在门、属水平的影响 本研究发现,5例婴幼儿使用抗生素后,肠道菌群在门水平的改变包括:肠道中拟杆菌门的上升、变形菌门的下降、厚壁菌门的下降以及厚壁菌门与拟杆菌门比例降低。厚壁菌门、拟杆菌门是人类肠道菌群中主要的细菌,占肠道微生物的95%以
A:抗生素使用前;B:抗生素使用后。Acinetobacter:不动杆菌属;
:芽胞杆菌属;B:拟杆菌属;Bacillusacteroidesiidobacterium:Bf:肠球菌属;双歧杆菌属;Eerthella:埃格特菌属;Enterococcusgg:scherichia:埃希杆菌属;Eubacterium:真杆菌属;LactobacillusE
:乳球菌属;O乳杆菌属;Lactococcusscillosira:颤螺菌属;Para-p:紫单胞菌属;R:瘤胃球菌属;Sacteroidesuminococcustahlo-bpy
:葡萄球菌属;S:链球菌属;Soccustretococcusutterella:萨特菌cp:未分类;O:其他属;eillonella:韦荣球菌;UnclassifiedthersV
图3 抗生素使用前后肠道菌群在属水平的变化情况
·500·,M中国微生态学杂志2016年5月第28卷第5期 ChinJMicroecola2016,Vol.28No.5 y
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《中华医学会儿科学分会呼吸学组;中华儿科杂志》编辑委员
([]下)会.儿童社区获得性肺炎管理指南(013修订)J.中华2():儿科杂志,8013,51115662.82-
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0100016280163522---- 收稿日期: 修回日期: 本文编辑:李兵
上,共同参与人体发育、生理调节、免疫、营养吸
18]
,厚壁菌门与拟收等各种生命活动。据文献报道[
杆菌门的比例被认为是肠道菌群组成的重要的指标。本研究中,5例患儿使用抗生素后肠道中厚壁菌/拟杆菌下降,这有可能会引起肠道营养吸收效率的降低,导致婴幼儿食欲不振、营养不良及消瘦的发生。变形菌门是细菌中最大的一门,均为革兰阴性菌,包括大多数的致病菌,如埃希菌属、沙门菌属、克雷伯菌属和志贺菌属等。本研究中,3例患儿使用抗生素后肠道内变形菌门相对丰度出现了下降,说明抗生素对变形菌门具有明显的抑制作用。
从属水平的分析结果还发现抗生素的使用不仅能够抑制有益菌群的生长,如双歧杆菌、乳酸菌属等的相对丰度下降;而且使一些潜在的致病菌的相对丰度在使用抗生素后有巨大的上升,如喜胆汁菌
[9]
在小鼠实验中属、梭菌属和支原体。Devkota等1
发现喜胆汁菌属能够抵抗胆汁对细菌细胞膜的破坏,并产生内毒素导致肠炎等疾病的发生。同样,梭菌属(包括艰难梭菌)也能够引起腹泻和肠炎等严重疾病,危及人类生命。.3 抗生素诱导耐药菌的产生和传播 抗生素的使3
用不仅可导致菌群紊乱,使肠道中细菌活性降低和
20]
,还能诱导耐药性细菌的产生和传基因表达变化[
[1]
,使用克拉霉素和甲播。akobsson等研究显示2J
硝唑治疗幽门螺杆菌感染,14d后患者肠道和咽部菌群的多样性明显减少,肠道菌群中大环内酯类耐药基因(ermB)呈10万倍增加,部分患者可长达4年不消退,提示即使短期使用抗菌药物,也可对人体的正常菌群构成及其耐药性造成长远的影响。本研究显示肺炎婴幼儿短期使用抗生素3~5d即出现肠道菌群多样性减少、结构紊乱,这可能是肺炎并发腹泻、甚至是抗生素使用以后引起一些疾病危险增加的机制之一。因此,临床医生在工作中应严格掌握使用抗生素的指征,慎用抗生素治疗。
本研究存在多菌的差异结果,P值都偏高,可能是由于样本量少导致的,后续需要更多的验证加以证实发现的结果,有待今后扩大样本进行长期深入的研究。参考文献
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