3 株鸭肝炎病毒1 型全基因序列分析

基金项目：国家自然科学基金“鸭肝炎病毒基因组结构研究”（30471283）。 第一作者简介：杨维星，女，1984年出生，湖北潜江人，硕士，研究方向为动物传染病学。通信地址：350013 福建省福州市新店埔党，Tel： 0591-87572396，E-mail：xingxinger86@163.com。 通讯作者：黄瑜，男，1965年出生，江西宁都人，博士，研究员，主要从事动物传染病研究。通信地址：350013 福建省福州市新店埔党，Tel： 0591-87572396，E-mail：huangyu_815@163.com。苏敬良，副教授，E-mail：jinglsu@yahoo.com。 收稿日期：2010-1-26，修回日期：2010-03-21。 3株鸭肝炎病毒1型全基因序列分析 杨维星 1,2，施少华 1,2，陈红梅 1,2，万春和 1,2，程龙飞 1,2， 傅光华 1，林 芳 1，林建生 1，苏敬良 3，黄 瑜 1 （1福建省农科院畜牧兽医研究所，福州 350013；2福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福州 350013； 3中国农业大学动物医学院，北京 100094） 摘 要：为分析3株1型鸭肝炎病毒（DHV）的遗传变异和进化关系；采用RT-PCR和5'-/3'-RACE.方法测定 3株 1型鸭肝炎病毒全基因序列；研究结果表明，不含 poly（A）尾巴的 3株病毒的基因组全长为 7691~ 7700 nt，基因组均仅含一个长度为6750 nt的ORF，625~627 nt 5'端非翻译区和325~328 nt 3'端非翻译区 (UTR)。将3株病毒株与GeneBank公布的其他DHV-1全基因序列及小RNA病毒科的其他属代表病毒 株进行序列分析表明，聚蛋白均被分割成为12个蛋白，其中VP1的变异性最大，180~187位为高变区。3 株病毒与DHV-1参考毒株核苷酸序列同源性在 93.7%~98.8%，氨基酸序列同源性在 96.9%~98.8%， DHV-1各株在小RNA科病毒多聚蛋白氨基酸序列进化树上形成一个独立的进化分支；DHVs-1病毒间 核苷酸和氨基酸仍较保守，它们在进化中可将其归为小RNA病毒科的一个新属。 关键词：鸭肝炎病毒1型；基因组；序列分析 中图分类号：S852.65+9.6 文献标志码：A 论文编号：2010-0256 Genomic Sequence Analysis of Three Strains of Duck Hepatitis Virus Type 1 Yang Weixing1,2, Shi Shaohua1,2, Chen Hongmei1,2，Wan Chunhe1,2, Cheng Longfei1,2, Fu Guanghua1,2, Lin Fang1, Lin Jiansheng1, Su Jingliang3, Huang Yu1 （1Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013; 2Fujian Animal Diseases Control Techology Development Center, Fuzhou 350013; 3College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100094) Abstract: This experiment was conducted to study the genetic variations and phylogenetic analysis of three strains of duck hepatitis virus type 1(DHV-1); The complete sequences of three DHVs-1(FZ86, FZ99 and FZ05) were acquired by RT-PCR and 5'-/3'-RACE; The results showed that the full genomic length of three strains virus were 7691-7700 nt without poly(A) tail, including 625-627 nt 5’UTR, followed by a long open reading frame(ORF) of 6750 nt and 325-328nt 3’UTR. The nucleotide sequences analysis of three DHV-1 strains and the cited DHV-1 isolates showed that their polyproteins can be cleaved into 12 proteins. In the 12 polyproteins, the VP1 polyprotein had large variation of aa180-187. The homologies of three DHVs-1 and other DHVs-1 were within 93.7%-98.8%, while the amino acid homology were 96.9%-98.8%. The DHV-1 strains clustered together and formed a separated sublinge with other numbers of the family Picornaviridae; DHVs-1 are conserved on nucleotide and amimo acid, and belong to a new genus in the family Picornaviridae . Key words: duck hepatitis virus type 1; genome; sequence analysis 中国农学通报 2010,26(14):8-12 Chinese Agricultural Science Bulletin 0 引言 鸭肝炎 (Duck Hepatitis, DH)是由鸭肝炎病毒 (DHV)引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害 3周龄内雏鸭，以肝炎为特征。该病发病急、病程短、 发病率和死亡率高，严重威胁养鸭业健康发展 [1]。 DHV分为 1型、2型和 3型，其中 1型呈世界范围分 布。在中国，最早于1958年发生鸭肝炎[2]。近年来，印 度、埃及和美国相继报道了1型DHV的变异情况。 1型DHV是一种无囊膜单股正链的RNA病毒，目 前归属于小RNA病毒科的未确定种[2-3]，其基因组大小 约为 7690 nt，具有 1个大的开放阅读框，编码 1个有 2 249个氨基酸的聚合蛋白；3’UTR长度约为314 bp，5’ UTR长度约为 626 bp。1型DHV多聚蛋白具有 11个 切割位点，且具有与小RNA病毒相似的切割位点和保 守基序[4-5]。1型DHV与双埃柯病毒属(parechovirus)的 关系相对比较密切，但认为1型DHV可能属于小RNA 病毒科的一个独立的病毒属。 通过对3株1型鸭肝炎病毒株进行全基因序列测 定，为进一步认识1型DHV的分子特征和研究该病毒 遗传变异等方面提供资料。 1 材料与方法 1.1 病毒株 FZ86株为 1986年分离于福建福州 10天雏番鸭， 暂命名为 FZ86；FS99株为 1999年分离于福建泉州 8 天野鸭，暂命名为FS99；FZ05株为2005年分离于福建 福州11天半番鸭，暂命名为FZ05。 1.2 主要试剂和仪器 RNA提取试剂、M-MLV反转录酶购自 Invirtogen 公司，Taq酶和 pMD18-T载体、5'-Full RACE Core Set 和 3'-Full RACE Core Set购自宝生物工程（大连）有限 公司；其他试剂均为国内分析纯。梯度 PCR仪为 Eppendorf公司产品。 1.3 病毒及RNA的提取 取经 3株病毒株感染的鸭胚尿囊液于 8000 r/min 4℃离心10 min以去除杂质，收集上清液。RNA提取 根据TRizol说明书操作，最后每250 μL尿囊液的病毒 RNA用20 μL DEPC水溶解。 1.4 RT-PCR 根据GenBank上登陆的DHV-1基因组序列，应用 Oligo 6.0软件设计引物。反转录按M-MLV Reverse Transcriptase 说明书进行，具体如下：将制备好的 RNA 5 μL，加入 200 pmol/L随机引物 1 μL，M-MLV RT 5×Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTP mixture 8 μL，40 U/μL Ribonuclease Inhibitor 1 μL，200 U/μL M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL，混匀后按以下程序进行 RT：30℃ 10 min，37℃ 60 min，99℃ 5 min，保存于 4℃。取 2 μL反转录产物，5×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP mixture 2 μL，MgCl2 2 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O补齐至 25 μL 后按以下程序进行 PCR：94℃ 5 min，94℃ 1 min， 50~55℃ 1 min，72℃ 1 min，共 35个循环，最后 72℃ 10 min，保存于 4℃。PCR产物用 1.0%（W/V）琼脂糖 凝胶电泳检测。 1.5 5’和3’末端的扩增 基因组的 5’和 3’末端的扩增按 5’-Full RACE Core Set和3’-Full RACE Core Set说明书进行。 1.6 克隆与测序 用DNA快速回收试剂盒纯化 PCR产物，连接至 pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，在LB抗性培 养基中过夜培养后，经菌液 PCR鉴定为阳性者，由 Invitrogen公司完成测序。 1.7 基因序列的拼接与分析 采用DNAStar的Seqman程序将序列测定结果进 行拼接[6]，获得 3株病毒株的全长基因组序列，将该序 列与GenBank中登陆的DHV-1序列进行比对，进行 DHV-1的同源性和遗传进化分析。 2 结果 2.1 基因组测序结果与序列分析 根据各片段间相互重叠的区域，利用Seqman程序 将3株病毒各基因片段的测序结果进行拼接，得到3株 病毒的全基因序列。不含 poly（A）尾巴的 3株病毒的 基因组全长为7 691~7 700 nt，基因组均仅含一个长度 为 6 750 nt的ORF，625~627 nt 5'端非翻译区和 325~ 328 nt 3'端非翻译区(UTR)。3株病毒株拥有11个切割 位点，可产生 3种结构蛋白（VP0、VP3、VP1）和 8个非 结构蛋白（2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。在这 12种蛋白中，VP1的变异性最大，其中180~187位为高 变区，未发现参与病毒吸附的RGD序列，而被SGD序 列所取代（见图1）。 2.2 聚蛋白切割位点预测 小RNA病毒多聚蛋白拥有内部连接位点[7-8]，多处位点 含有被 3C所识别并切割的一级或三级结构元件。 CLUSTAL W结果表明，3株病毒与LV聚蛋白的氨基 酸同源性最高（30.7%~30.8%），因此通过比较这3株病 毒与LV聚蛋白氨基酸序列来预测这 3株病毒的聚蛋 白切割位点。预测切割位点Q/G位于VP0/VP3、VP3/ 杨维星等：3株鸭肝炎病毒 1型全基因序列分析 ·· 9 中国农学通报 http://www.casb.org.cn VP1、2C/3A、3B/3C和 3C/3D，Q/S位于 2A/2B、2B/2C 和 3A/3B，而 VP1/2A 切割位点则是 E/S。在 3 株 DHV-1的 2A蛋白上有典型的口蹄疫病毒样切割位点 NPG|P，在此位点上可将2A蛋白切割成结构不同2A1 和 2A2，此预测结果与 Kim等的报道一致 [7]。正如 Ljungan病毒和多数小RNA病毒VP4/VP0的N端存在 豆蔻酰化信号序列(Gxxx[S/T])[8]，x为非保守氨基酸) 一样，在 3株DHV-1的多聚蛋白前体位点 L/G间(第 30~31位)亦发现有该信号序列(GAVES)，据此推测 3 株DHV-1的聚蛋白的N端均存在一个长度为 30 aa的 前导蛋白(Leader protein，L)。因此，3株病毒的基因组 结构为：5'UTR-L-VP0-VP3-VPl-2A1-2A2-2B-2C-3A-3 B-3C-3D-3'UTR。 2.3 遗传进化分析 FZ86与DHV-1参考株全长核苷酸序列同源性为 94.3%~98.4%，多聚蛋白氨基酸序列同源性为 97.1%~ 98.8%；FS99与DHV-1参考株全长核苷酸序列同源性 为 93.7% ~97.6%，多聚蛋白氨基酸序列同源性为 97.2%~98.8%；FZ05与DHV-1参考株全长核苷酸序列 同源性为 93.6%~96.7%，多聚蛋白氨基酸序列同源性 为96.9%~98.8%。FS99与FZ86和FZ05的全长核苷酸 序列同源性分别为95.7%和93.7%，多聚蛋白氨基酸序 列同源性分别为97.8%和97.4%，FZ86与FZ05的全长 核苷酸序列同源性为 94.2%，多聚蛋白氨基酸序列同 源性为97.2%（见图2、图3）。 对 29株小 RNA病毒科各属代表病毒和 15株 DHV-1的全长多聚蛋白氨基酸序列进行种系进化 分析，结果显示，DHV-1各株在小 RNA科病毒多聚 蛋白氨基酸序列进化树上形成一个独立的进化分 支，相比于其他小 RNA病毒，该分支与双埃柯病毒 属（Parechovirus）亲缘关系较近，然而 DHV-1与 LV 和 HPeV的多聚蛋白序列同源性也低于 30%，显示 DHV-1可能是小 RNA病毒科的一个新属病毒（见 图 4）。 3 讨论 通过对福建分离的3株不同时期1型鸭肝炎病毒 株基因组进行克隆测序，分析发现 3株DHV-1基因组 具有典型的小RNA病毒特征，如基因组仅含有一个大 图1 3株病毒与DHV-1之间VP1蛋白比较 2.5 2 0 图2 3株病毒与参考株多聚蛋白氨基酸进化分析 ZJ HDHV1-GS FZ86 E53 SD FZZ05 FZ05 R85952 A66 C80 JXmRNA 03D FS99 DRL-62 5886 Nucleotide Substitutions(×100) ·· 10 的开放阅读框、5’和 3’末端为非翻译区、3’末端带有 一个Poly(A)尾巴，这3株病毒多聚蛋白存在11个切割 位点，可被切割为12个成熟产物等结构。通过基因组 核苷酸序列建立的进化树分析发现DHV-1在小RNA 病毒科的多聚蛋白进化树上形成一个独立的分支，这 一结果与Tseng等[8]的研究结果基本一致，显示可能是 小RNA病毒科的一个新属病毒。 在 3株DHV-1的 2A蛋白上有典型的口蹄疫病毒 样的切割位点NPG|P，和LV类似，DHV-1的2A蛋白由 结构不同的蛋白组成，预测结果与Kim等[7]的报道一 致，即DHV-1的 2A蛋白是由 2种不同的 2A小蛋白 （2A1和 2A2）串联而成。而Tseng等 [9-10]则认为，除了 形成一种成熟的蛋白（2A2）外，2A还形成另一种成熟 蛋白（2A3）。对于FMDV VP1蛋白大部分暴露在病毒 5.2 2 04 A66 JXmRNA C80 03D ZJ HDHV1-GS E53 SD FZ86 FZZ05 FZ05 R85952 DRL-62 5886 Nucleotide Substitutions(×100) 图3 3株病毒与参考株全长核苷酸进化树 03D FS99 5886 DRL-62. FZZ05 FZ05 R85952 ZJ HDHV1-G3 E53 FZ86 SC A66 C80 JXmANA HPeV1 HPeV6 HPeV2 HPeV4 HPeV3 LV174F LV87-012 LVM1145 AEV HAV HEV-B HEV-D SEV-A HEV-C PV BEV PEV-B HEV-A HRV HRV-B PEV-A EMCV ThV ERAV FMDV ERBV PTV Aiv BKV DHV-1 Parechovirus Hepatovirus Enterovirus Rhinovirus Enterovirus Cardiovirus Aphthovirus Erbovirus Teschovirus Kobuvirus 208.6 200 150 100 50 0 图4 DHV-1与参考株及小RNA各属代表株多聚蛋白氨基酸比对进化树 杨维星等：3株鸭肝炎病毒 1型全基因序列分析 ·· 11 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 的表面，是决定病毒抗原性的主要成分，能诱导动物产 生中和抗体，也是抗原性的高变区。一般认为，衣壳蛋 白VP1上的RGD序列是细胞表面受体的配体，是小 RNA病毒科病毒侵染细胞所必需的，但DHV-1没有此 RGD序列，取而代之的是SGD，这是否说明DHV-1有 自己独特的配体有待这一步研究。 参考文献 [1] Sandhu T S, Calnek B W, Zeman L. Pathologic and serologic characterization of a variant of duck hepatitis type I virus[ J].Avian Dis.1992,36(4):932-936. [2] 郭玉璞,蒋金书.鸭病[M].北京:北京农业大学出版社,1988:30-31. [3] Ding C Y, Zhang D B.Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1[J].Virology,2007,361:9-17. [4] Kuhn R, Luz N, Beck E. Functional analysis of the internal translation initiation site of foot-and-mouth disease virus[J].J Virol, 1990,64(10):4625-4631. [5] 黄显明,张小飞,魏建忠,等.1型鸭肝炎病毒的研究进展[J].动物医 学进展,2007,28(11):78-81. [6] Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al. The CLUSTAL X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Res,1997, 25(24):4876-4882. [7] Kim M C, Kwon Y K, Joh S J,et al. Recent Korean isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of a new geno- and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strains[J].Arch Virol,2007,152(11):2059-2072. [8] Chow M, Newman J F, Filman D, et al.Myristylation of picornavirus capsid protein VP4 and its structural significance[J]. Nature. 1987, 327(6122):482-486. [9] Tseng C H, Tsai H J. Molecular characterization of duck hepatitis virus[J].Virus Res,2007,126(1-2):19-31. [10] Tseng C H, Knowles N J, Tsai H J.Molecular analysis of duck hepatitis virus type Ⅰ indicates that it should be assigned to be a new genus[J].Virus Res,2007,123(2):190-203. ·· 12