性别控制

null胚胎性别控制、性别鉴定 与单精注射胚胎性别控制、性别鉴定 与单精注射主讲人 邓双义内容提要内容提要性别控制 性别鉴定 单精注射性别控制 性别控制 性别控制（Sex Control）是经过人为干预，使动物的后代按人们所需的性别而繁衍的技术。 其目的有三： 1）可以从受性别限制的性状和其相应受影响的性状上获益，如母畜产奶，公畜产肉等； 2）消灭不理想的隐性性状，防止性连锁疾病； 3）加快遗传进展及畜群的更新。 性别决定的生物学机制 性别决定的生物学机制 1．性别决定的发育学机制 2．性别决定的遗传学机制 性别决定的发育学机制 性别决定的发育学机制 家畜胚胎发育的早期阶段为性别未分化期，仅有位于中肾内缘的性腺原基，这种未分化的性腺中胚层处于中性。家畜性别决定的取向是未来性腺发育的导向，而性别决定的结果又是通过性腺分化及性表型来体现的。 性别决定的遗传学机制 性别决定的遗传学机制 Sinclair et al. (1990)在人类Y染色体的短臂近似常染色体区域分离和克隆到一个单拷贝基因，与性别决定相关，称之为性别决定区Y基因（Sex-determined region Y-linked gene, SRY;小鼠用Sry表示）。其编码蛋白SRY所含HMG box在许多动物中保守，并在成年动物睾丸中特异表达。 SRY/Sry现已在包括有袋类和真兽亚纲动物在内的哺乳动物Y染色体上发现了其同源基因。SRY/Sry不但与睾丸决定有关，而且还是睾丸决定过程中所必需的唯一来源Y染色体的基因。 性别控制的途径 性别控制的途径 就目前研究的内容，对家畜性别控制主要从两个方面进行： 一、人工受精过程的性别控制； 二、胚胎移植过程中的性别控制。 人工受精过程中的性别控制 人工受精过程中的性别控制 人们已确认动物的性别是由X和Y染色体决定的。由于X精子与Y精子之间存在着微弱的生物学差异，如根据精子的形态、比重、膜电荷、抗原性、对酸碱的敏感性、运动性等不同，进行各种试验，识别带有X染色体和Y染色体的两类精子，并将它们分开，进行人工受精，这样可以控制家畜性别；或对公、母畜同时施用内、外源激素等综合，来控制家畜的性别。但没有取得较为理想的结果。 胚胎移植过程中的性别控制 胚胎移植过程中的性别控制 正常受精卵是从卵子获得一条X染色体，再从精子获得一条X染色体或Y染色体，以此决定胚胎的性别。据此，人们对早期胚胎利用特异性DNA探针或PCR技术进行鉴定，然后按要求选择特定胚胎，这些胚胎移植后可以正常发育为预定性别的个体，从而达到控制家畜性别之目的。 精子分离与鉴定的方法 精子分离与鉴定的方法 X，Y精子的生物学差异 精子分离的研究现状 X，Y精子的生物学差异 X，Y精子的生物学差异 Y精子F小体 精子的重量 精子运动和表面电荷 精子表面H-Y抗原的分布 精子的耐酸碱性 Y精子F小体 Y精子F小体 1968年Cosperson等以奎纳克林-马斯德氏法在研究男性染色体时发现，在Y染色体长臂末端发出有比其它部分强的荧光亮点，将这些点称为F-A小体， 1970年Barlow等首次报道在Y精子头部发现F小体。且F小体在人和家畜的精子上都能见到。后来经实验反复证明，有F小体的精子一定是Y精子，而没有的则是X精子。 精子的重量 精子的重量 X与Y精子在重量和比重上的唯一差别是两者所含DNA量的不同。X染色体比Y染色体体重大，DNA含量多。两者DNA含量的差异牛为3.9％，绵羊为2.4％，田鼠为12.5％。家畜的差异一般在3～5％之间。由于重量的差异，从而引起精子在稀释液中的运动力、沉降速度等不同。 精子运动和表面电荷 精子运动和表面电荷 一般认为Y精子比X精子的活力强，且在含有血清白蛋白的稀释液中能沿直线运动。精子的表面均带有负电荷，但X、Y精子表面膜电荷的分布有差异。Y精子尾部膜电荷量较高，而X精子头部膜电荷含量较高。由于其电荷量分布不同，因此精子在缓冲液中电泳时，阳极方向得到的X精子多，阴极方向的Y精子多；但是也有的报道结果与上述相反 精子表面H-Y抗原的分布 精子表面H-Y抗原的分布 H-Y抗原即雄性特异性组织相容性抗原。早在1955年由Eichwald和Silmser观察到雌性C57BL/6小鼠排斥同种雄鼠皮肤移植片时提出的。Gikberg等（1971）在早期H-Y抗原检测所涉及的细胞毒性实验中发现，在一份精液中大约有50％的精子被致死，猜想可能死精子是Y精子。H-Y抗原是一种弱抗原，其分布依精子的来源不同而有差异，由附睾头分离的精子H-Y抗原主要分布于靠近精子的尾部。附睾尾分离的精子H-Y抗原主要分布在顶体后端，而绵羊和牛射出的精子H-Y抗原则分布在顶体后部和尾部中段。已证实，只有Y精子才能表达H-Y抗原。 精子的耐酸碱性 精子的耐酸碱性 在弱酸弱碱中， Y精子嗜碱而不耐酸， X精子与之相反。 精子分离的研究现状 精子分离的研究现状 沉淀法 离心法 电泳法 免疫学分离法 免疫亲和柱层析法 Y特异性DNA探针法 用控制酸碱度来控制性别 流式细胞分类器 沉淀法沉淀法 Schilling(1971)用卵黄缓冲液层析牛精液，放置一段时间让其自然沉淀，用其下层精液受精，母犊比例达到70％，Bhattacharya等（1977）沉淀牛精液，上部81.1％为Y精子，底部91.1％为X精子。 离心法 离心法 Lindahl(1970)在12～20℃环境下离心牛精子，将上下层分别给母牛输精，上层产公牍58.7％（27/46），下层产母犊58.73％。Shastry等（1977）用聚蔗糖胶体密度梯度分离出73﹪的含F小体的精子。玲木达行（1986）用Perool密度梯度分离牛精子，将分离出的X精子层给母牛受精所得母犊77.8％，Ogawa等（1987）用密度梯度离心法分离猪精子，在管底层收集到的精子中，有F小体的精子为10.1％。 电泳法 电泳法 Shoredon(1932)用电泳法分离牛精子，分别收集向两极运动的精子。阳极雌性占71.3％，阴极雄性占63.8％；Mobri等（1986）用自由泳法处理人的精液时发现，在PH7.4时，阳极侧多为X精子，阴极侧（80％）多为Y精子，但Engelmannl等（1988）用此方法却得到与此完全相反的结果。 免疫学分离法 免疫学分离法 此方法是利用H-Y抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原，以此分离X精子和Y精子。由于H-Y抗原极弱，因此对细胞表面H-Y抗原进行血清学和免疫化学的检测曾一度被搁置起来，随着生产高效价H-Y抗体方法的发展，极大地促进了对H-Y抗原的生化和血清学研究，免疫亲和柱层析法 免疫亲和柱层析法 Bryant(1980)应用H-Y抗体免疫亲和免疫柱层析法，首次成功地分离人和小鼠的H-Y阳性和阴性精子。 免疫亲和柱层析法，目前还不能适用于大规模精子分离，仅限于小范围试验。主要是经层析后幸存的精子相对较少，且活力底难以应用。 Y特异性DNA探针法 Y特异性DNA探针法 Jone等（1987）曾用DNA探针来鉴定精子的性别，但所有的探针要进入到细胞核中的DNA上，从而引起精子破坏，所以实用价值不大。 用控制酸碱度来控制性别 用控制酸碱度来控制性别 近年来，人们试图在受精时，通过阴道输入精氨酸，用改变生殖道PH环境的方法，达到选择性利用精子控制性别的目的。从生产的意义上将，如果能用控制酸碱度的方法来控制性别，将是一个简单、经济且适宜于生产的方法。虽然上述的许多报道称雌性比率可达75％，但都经不住严格试验设计的验证。持否定观点的报告亦很多。流式细胞分类器 （Flow Cytometer of Flow Cytometer/Sorter） 流式细胞分类器 （Flow Cytometer of Flow Cytometer/Sorter） 是一种分析细胞和对细胞进行荧光染色分类的仪器。用此方法分离的精子经输卵管输精或体外受精，已获得了预期性别的牛、兔、猪和绵羊的活后代。牛分离后精子用于体外受精、将胚胎移植给9头受体牛，其中4头妊娠产下6犊，3头雄性，3头雌性，均与预测性别相符（Gran等1993）。null 除上述方法外，还有白蛋白沉淀法、流动分离法、层流分离法、Y特异性DNA探针法等分离精子和控制性别的方法。这些控制家畜性别的研究，取得一定成就，但迄今为止，在分离精子控制性别方面所做的种种努力和尝试均未取得令人满意的成果。而应用流式细胞分类器分离精子，已取得了比较准确的结果。 胚胎性别鉴定 胚胎性别鉴定 目前，较理想的家畜性别控制的途径是进行胚胎的性别鉴定。将移植前胚胎进行性别鉴定对畜牧业生产具有重要意义。根据胚胎性别鉴定方法的性质，性别鉴定可分两大类，非分子生物学方法和分子生物学方法，其发展过程也是由非分子生物学方法到分子生物学方法的过渡的，即古老的核型分析—免疫学方法—分子生物学方法的过程。家畜性别控制可以通过对其胚胎进行鉴定，然后按人们所需的性别进行移植，人为地改变畜群的性比例，以达到性别控制的目的。 胚胎性别的鉴定方法 胚胎性别的鉴定方法 细胞学方法 生物化学法 免疫学方法 分子生物学方法 细胞学方法 细胞学方法 主要是指通过核型分析，对胚胎进行性别鉴定。该方法是将胚胎用含有丝分裂阻滞剂的培养液培养，然后诱使细胞肿胀及染色体扩展并加以固定、染色，在显微镜下检查。其准确率为100％，但要获得高质量的中期染色体分散相难度很大，其中分散相的获得率为61.0％～81.0％，能进行鉴定者从6.7％到60％。这样对胚胎浪费大且费时极多。虽然与胚胎分割技术结合鉴定一半胚胎，冷冻或移植已知性别的半胚胎，已获得性别鉴定的牛（Seike 1986），但此法难以用于生产， 生物化学法 生物化学法 是通过测定与X染色体相关的酶活性，来鉴定雌性胚胎的一种方法。其原理是早期雌性胚胎的两条X染色体中有一条失活。在胚胎基因组的激活与X染色体失活之间的短暂时期内，雌性的两条X染色体都可以被转译，这反映在雌性胚胎中与X染色体相关酶的细胞内浓度及活性是雄性胚胎的两倍。这即为胚胎性别鉴定的依据。但这种方法对致密桑椹胚或囊胚阶段的胚胎应用有困难，且由于X染色体失活的确切时间不清楚，容易引起误判。 免疫学方法 免疫学方法 是指利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原，而进行的胚胎鉴别方法。 细胞毒性分析法 间接免疫荧光法 囊胚形成抑制法 细胞毒性分析法 细胞毒性分析法 将H-Y抗血清与补体（鼠血清）加入培养液中对胚胎进行培养，将在培养过程中继续发育胚胎判H-Y阴性。将出现个别卵裂球溶解以及不能发育到囊胚者判为H-Y阳性（雄性）将受阻胚胎取出置于不含H-Y抗体的培养基中孵育数小时后，抑制被解除，该胚胎继续发育。但这种方法是以破坏雄性胚胎为代价，近年来已很少使用。 间接免疫荧光法 间接免疫荧光法 将胚胎先用H-Y抗体处理30min，再用异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的二抗处理、拘特异荧光来判断。有荧光者为雄胚，无荧光者为雌胚。这种方法的优点是不损害胚胎，鉴别的准确率也不低，但其不足是对荧光强度的估计有主观性。此外，荧光强度对胚胎质量也有一定影响。 囊胚形成抑制法 囊胚形成抑制法 是利用H-Y抗体对雄性桑葚胚向囊胚发育具有可逆性抑制的原理发展起来的一种胚胎性别鉴定法。其不足之处是容易将一部分发育迟缓的雌性胚胎误判为雄性胚胎。 分子生物学方法 分子生物学方法 PCR-SRY PCR-ZFX/ZFY PCR-AML LAMP PCR方法概述PCR方法概述nullPCR-SRY PCR-SRY 1990年7月英国科学家发现哺乳动物的性别决定区（Sex-determin region of the Y,SRY）位于Y染色体短臂|A|区中的35Kb的序列内，是一个长约250bp编码，由80个氨基酸组成的单拷贝基因。1991年7月曾溢涛和胡明信应用DNA直接测序法测定了牛SRY基因的“核心序列”，在此基础上设计合成了两对牛SRY序列特异的PCR扩增引物，建立了超微量扩增单拷贝SRY基因的技术方法。并应用PCR专一性来扩增牛胚胎性别。移植后获得了鉴定性别相符合的活犊。PCR结果图示PCR结果图示样品孔内标雄性特异条带♀♂♂PCR-ZFX/ZFY PCR-ZFX/ZFY Aasen E等（1990年）扩增ZFY/ZFX基因用来鉴定人、牛、绵羊和山羊的性别。使用一对通用引物扩增ZFY/ZFX的基因后再进行RFLP分析，在两性别之间产生不同的酶切片段，达到胚胎性别鉴定。2000年Virta J等用荧光探针鉴定牛胚胎性别。即ZFX/ZFY同其它基因组区域同时扩增扩增产物作为模板用巢式引物和性别特异荧光探针杂交。省却了电泳检测的步骤。 PCR-AML PCR-AML 1991年Gibson发现牛牙釉蛋白基因有两种不同的转录产物，其转录本分别定位于X、Y染色体上。1994年Ennis, S等在缺失位点两端合适位置设计一对引物，可同时扩增出两种产物，以此判断牛胚胎的性别。1999年Chen, C.M.等对牛牙釉蛋白(bAML)基因克隆测序，设计一对特异引物同时扩增X染色体和Y染色体，结果雌性基因组只能扩增出一种产物，而雄性基因组可扩增出两种产物。一对引物既可作特异反应引物，又可作内标。 LAMP LAMP LAMP法(Loop-mediated isothermal amplification method)是由Notomi, T等于2000年开发出来的一种新式恒温核酸扩增方法。它采用两对识别六个特异靶序列的引物，在恒温（65℃）DNA聚合酶的作用下对目的序列进行指数级扩增，可在不到一小时的时间里靶序列的拷贝数达107-9级。其产生的副产物白色焦磷酸镁沉淀可作为靶序列是否扩增的依据。该方法具有快速、灵敏、特异、简便、高通量、易检测等优点。LAMP结果图示LAMP结果图示显微受精显微受精 显微受精（microfertilization)是20世纪80年代后期才发展起来的一种体外受精技术，即借助显微操作仪将精子或生精细胞直接注入卵母细胞质内(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)或卵周隙即透明带下(sub-zonal injection,SUZI)来实现受精的过程。该方法可用于性别控制。即先将XY精子分离，然后再用显微受精的方法获得所期望的胚胎用途用途基础研究 提高良种公畜的利用率 保护野生动物资源 拯救珍稀动物 治疗男性不育 性别控制显微受精的基本操作方法显微受精的基本操作方法透明带打孔（zona pellucida drilling, ZPD）技术 透明带带下注射法（ sub-zonal injection, SUZI） 胞质内注射法（ intracytoplasmic sperm injection ,ICSI）透明带打孔（ZPD）技术透明带打孔（ZPD）技术 为了便于精子进入卵母细胞，在透明带上钻开或打开一个小孔即透明带打孔技术。打开透明带有两种方法：一种是透明带穿孔，即在注射管中放入一种酸性溶剂（干酪酸，pH2.6），将注射管放到需要穿孔的透明带处，酸性溶剂附着在该点形成一个小孔。另一种打开透明带的方法是透明带部分开孔技术，其方法是先用固定针固定卵母细胞，用刚拉好的针沿切线方向穿透透明带，并在固定针上将透明带磨破，三是激光打孔。图示图示固定针透明带酸性溶剂卵母细胞透明带带下注射法（ SUZI）透明带带下注射法（ SUZI）将一个或多个精子注入卵周隙即为透明带带下注射法受精。固定针卵母细胞透明带精子 注射针胞质内注射法（ ICSI）胞质内注射法（ ICSI） 将精子直接注入卵母细胞细胞质以完成受精过程的方法称为胞质内注射法。此种方法对精子类型几乎没有什么限制，即使精子细胞也能使卵母细胞受精，只要是活精子，无论是射出的、附睾的、还是睾丸中的精子。图示图示固定针卵母细胞透明带精子 注射针