EBV-LMP1 对鼻咽癌细胞系CNE1 细胞转移相关因素的影响

《癌症》Chinese Journal of Cancer，2003，22(5)：481—485 481 EBV．LM P 1对鼻咽癌细胞 系 CN E 1 细胞转移相关因素的影响 苟新敏 。， 陈 燕 ， 陈小毅 ， John R Arrand Effects of Epstein—Barr Virus Latent Membrane Protein 1(EBV．LM P1)on Related Factors of Metastasis of Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line CNE1 Gou Xin．Min ．Chen Yan ．Chen Xiao．Yi ， John R Arrand 1．广东医学院病理教研室， 广 东 湛江 524023； 2．Institute for Cancer Studies， University of Birmingham， Vincent Drive，Birm ingham B15 2Tr，UK J．Department of Pathology, GuangdongMedical College， Zhanjiang， Guangdong,524023， P．R．C ina 2．Institute for Cancer Studies， University ofBirmingham，Vincent Drive， Birmingham B15 2 UK 通讯作者：陈小毅 Correspondence to：Chert Xiao-Yi Tel：86—759 —2388584 E—mail：xychen@ gdmc．edu．cn 收稿 日期：2002．09—06 收回日期：2002—12—09 · 基础研 究 · 【ABSTRACT l BACKGROUND&OBJECTIVE：It has been proved that Epstein— Barr virus (EBV)Iatent membrane protein 1 (EBV—LMP1)can nduce the expression of matrix metaIIo0rotelnase一9 (MMP一9)．This study was designed to nvestigate the effect of EBV—LMP1 on related factors of metastasis of nasOpharVngeaI carcinoma celI Iine CNE1． METHODS： Expression of MMP一9 was studied in human NPC celI Iines cultured in vitro：CNE1 (welI differentiated celI Iine of NPC)and CNE1一GL (CNE1 celI Iine transfected with an eukaryotic LMP1一expression plasmid) by SP immunohistochemistry and Western blot analysis．Cell—matrix adhesion assay was used to study the adhesive ability of CNE1一GL cells．The effects of LMP1 on the invasion and migration of CNE1 cells were investigated by transwelI methods RESULTS： MMP-9 was expressed in both celI Iines but the intensity of the staining was different．The positive rates Of expression of MMP一9 n CNE1 and CNE1一GL cells were 3O．2％ and 98．2％ ． respectively(P <0．05)．The Increased expression of MMP一9 was also shown in CNE1一GL cells by Western blot analysis．Cell—matrix adhesion assay showed that the adhesive ability of CNE1-GL with the matrix (mean A value：1．2508± 0．071 1)was higher than that of CNE1 celI(mean A value：0．9519±O．068)(P <0．OO1)．Invasion assay and migration assay showed that the invasion and migration of CNE1一GL cell were higher than those of CNE1 cells (P <0．01)． CONCLUSION：The transfection of LMP1 can increase the expression of MMP．9 in CNE1 cells．Abilities of adhesion，migration，and nvasion of CNE1 cel1 were induced by LMP1． It is suggested that MMP一9 may have a role in the LMP1一induced acceleration of Invasion and metastasis of NPC cells． KEYW ORDS： NasOpharyngeaI neoplasms；Epstein—Barr virus latent membrane protein 1(EBV—LMP1)；M a1rix metalloproteinase-9 (MMP-9)：CelI adhesion； Metastasis；Invasiveness． 【摘 要】 背景与目的：已证实 EB病毒 (Epstein．Barr virus，EBV)编码的潜伏膜蛋 白 1 (1atent membrane protein 1，LMPI)能够诱导鼻咽癌细胞中基质金属蛋白酶 9 (matrix metalloproteinase-9，MMP一9)的表达。本实验的目的是观察 EB病毒潜伏膜蛋 白 1(EBV—LMPI)对鼻咽癌细胞系 CNEI细胞转移相关因素的影响，探讨 LMPI在鼻 咽癌侵袭、转移过程中的作用。：用免疫组化法及 Westem blot法检测 CNEI—GL (转染 LMPI基因的 CNEI细胞)和 CNEI细胞中MMP一9的表达情况；用细胞 一基质 粘附实验、细胞运动实验和肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验检测 LMPI对 CNEI细胞 粘附 、运动及侵袭能力的影响。结果：免疫组化法及 Western blot法结果均显示 CNEI—GL细胞中MMP-9的表达明显高于 CNEI细胞 (P<0．05)：肿瘤细胞 一基质 粘附实验结果显示，CNEI—GL的粘附能力(平均吸光度值为 1．2508±0．071 1)，高于 ： T 维普资讯 http://www.cqvip.com 482 苟新敏，等 ．EBV—LMPI对鼻咽癌细胞系CNEI细胞转移相关因素的影响 CNE1细胞(平均吸光度值为 0．9519±0．068)，两者相比差异 有显著性(P<0．O1)。运动实验及重组基底膜侵袭实验结果 均显示，穿过游离的聚乙烯吡略烷酮膜 (polyvinyl pyrroli— done—free．PVP—F)的CNEI—GL细胞数明显高于CNEI细胞(P< 0．01)。 结论：LMPI能够诱导 CNE1细胞中 MMP一9的表达， 且增强 CNEl细胞与基底膜的粘附能力 、运动能力及侵袭能 力。 关键词 ：鼻咽肿瘤 ；EBV—LMPI；基质金属蛋白酶；细胞粘附； 肿瘤侵袭；肿瘤转移 中图分类号：R739．63 文献标识码：A 文章编号：1000—467X(2003)05—048】一O5 鼻咽癌是中国南方常见的恶性肿瘤 ，转移率较 高，但其转移机制尚不清楚。最近有研究提示 EB病 毒(Epstein．Barr virus，EBV)与鼻咽癌的转移有关⋯， 特别是EBV潜伏膜蛋白1(1atent membrane protein 1， LMP1)，据报道 LMP1在鼻咽癌细胞中可以通过 NF．KB、AP．1促进基质金属蛋白酶 9(matrix meta1． 1oproteinase．9，MMP．9)的表达 。突破基底膜是肿瘤 细胞进行浸润及转移的最初和最关键阶段。近年研 究表明，MMP家族成员中的 MMP．2、MMP．9能够有 效地分解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原蛋白，两者 的过度表达与许多人类恶性肿瘤的转移密切相关 【3 J 。 转移过程的完成决定于肿瘤细胞的粘附性、运动 力、侵袭力等生物学特性以及宿主因素。在鼻咽癌细 胞系中 LMP1可以促进 MMP．9的表达升高，那么 LMP1对鼻咽癌细胞粘附、运动和侵袭能力有无影 响?本实验通过对 CNE1细胞和稳定表达 LMP1的 CNE1．GL细胞进行研究，观察 LMP1对 CNEI细胞 转移相关因素的影响。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 细胞系 CNE1为人鼻咽高分化鳞状细胞 癌 细胞株 ，CNE1．GL为 由陈燕转染 的稳定表达 LMP1的CNE1细胞株[41，两者均由广东医学院病理 学教研室保存。CNE2．Z是低分化鼻咽癌细胞株，作 为 MMP．9的阳性对照 。 1．1．2 主要试剂及仪器 鼠抗人 MMP．2单克隆 试剂 、鼠抗人 MMP．9单克隆试剂、免疫组化 sP试剂 盒均购自福州迈新公司；硝酸纤维素滤膜购 自美国 GENE公司；Western blot试剂盒购 自北京中山公 司；Matrigel(r)、纤维粘连蛋白购自Becton Dickinson Biosciences，U．S．A．；Transwell(r)，6．5 mm Diame． ter，8．0 ixm Proe Size，购自Coming Costar Corpora． tion．U．S．A；按 1：1自配甲醇：丙酮固定液，甲醇 、 丙酮均购于广州化学试剂厂。 1．2 方法 1．2．1 CNE1和 CNE1．GL细胞中 MMP．9的检测 采用免疫组化法检测 CNE1、CNE1．GL细胞中 MMP．9的表达情况。方法参照福州迈新公司sP试 剂盒书，以PBS代替一抗作阴性对照。Western blot法检测 CNEI和 CNE1．GL细胞中MMP-9的表达， 将 CNE1、CNE1．GL细胞培养24 h后去培养液 ，PBS 洗 2次，用 1 xSDS上样缓冲液裂解细胞后提取蛋 白，以Bradford法制备蛋白曲线，紫外分光光度 法测 595 nm处吸光度值(4s )，以SPSS10．0软件作 线性回归分析，得回归方程：蛋白浓度 (p~g／m1)= 25．503 X A 一2．339。取等量蛋白上样于 SDS．聚丙 烯酰胺凝胶中，恒压电泳 150 V，90 min。用电转法 将凝胶上蛋白转移至硝酸纤维素滤膜上，用 MMP．9 单克隆抗体与之结合，辣根过氧化物酶法显色。 1．2．2 细胞 ．基质粘附实验 用无血清培养基 RPMI．1640将 Matrigel配制成 0．04 ，／tzl的人工基 底膜胶备用；96孔板每孔中铺 Matrigel 2 ixg，即人工 基底膜胶每孔 50 l，放于超净台中风：f过夜；96孔 板每孔加人适量无血清 RPMI．1640细胞培养液，放 置 60～90 min，洗去多余的胶；挑选生长状态良好的 细胞，常规消化 、吹打成细胞悬液，记数，以4 X 10 ／ 孔接种在铺胶的 96孔板中，放人 37~C、5％ CO 培 养箱培养 2 h或／和 8 h；取出96孔板，倒去生长液， 每孔加入结晶紫 100 l，染色 10 min，PBS冲洗 3 X 5 min；每孔加人醋酸乙醇 100 p．1，酶标定量仪测定 570 nm处吸光度值。 1．2．3 细胞运动实验 在 24孔培养板的孔内装 满含有 10 tzg／ml纤维粘连蛋白的完全生长液；选 对数生长期的 CNE1和 CNE1．GL细胞各一瓶，常规 消化，吹打，记数，用含有 10％小牛血清白蛋白的 RPMI．1640细胞培养液将细胞配制成 5 X 10s／ml的 细胞悬液；在 Transwell小室的腔内加人 3 X 10 个细 胞；将 Transwell小室浸于 24孔培养板的条件培养 基中，5％ CO 、37~C孵箱中孵育24 h；将 Transwe11小 室取出，弃去液体，置于甲醇 ：丙酮 (1：1)固定液中 固定 5 min；小心用棉签擦尽上室膜面的细胞，将 Transwell小室置于 HE染液中染色，取膜，脱水，干 燥，封片；于 400倍光镜下记数 10个视野的肿瘤细 胞数，取均值。 1．2．4 肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验 用高压灭 菌处理过的三蒸水将 Matrigel稀释至 200 g／ l； ¨ 维普资讯 http://www.cqvip.com 苟新敏，等 ．EBV—LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞转移相关因素的影响 483 在 Transwell小室的室腔内加入 50 l稀释好的Ma— trigel，置超净台内风干过夜；用预热的 RPMI一1640培 养液注满上室，置于摇床中振摇 90 rain；弃去细胞培 养液，24孔培养板内加入含 1％纤维粘连蛋白的完全 生长液，每孔 600 ixl；收集对数生长期的细胞，记数， 用含 10％小牛血清的RPMI 1640培养液将细胞制成 5 x 105／ml的悬液；将细胞悬液加到 Transwell小室 中，每小室 100 l(即 5 x 1 04／孔)，将小室浸于 24孔 培养板的条件培养基中，5％ COz、37~C孵箱中孵育24 h；将 Transwell小室取出，滤膜用甲醇：丙酮 (1：1)固 定液固定 5 min；HE染色；棉签擦去未穿过膜的细胞， 将膜封于载玻片上，于 400倍显微镜下记数侵袭细胞 数，每膜记数 10个不同视野的细胞数，取均值。 1．3 统计学方法 研究资料采用计算机医学统计软件 SPSS10．0 做方差分析和卡方检验。 2 结 果 2．1 MMP．9在 CNE1、CNE1-GL细胞中的表达 MMP一9主要 以细颗粒状分布于细胞 的胞膜 及胞浆中。两种细胞中均有 MMP一9的表达 ，但染 色强度 明显 不 同 (见表 1及 图 1)，MMP一9在 CNE1一GL细胞 中的表达明显 高于 CNE1细胞。 Western blot法亦显示 MMP一9的表达在 CNE1一GL 细胞中明显高于 CNE1细胞(见图 2)。 表 1 两种细胞中MMP-9表达情况 Tab．1 Expression of MM P-9 in Two NPC Cell Lines MMP一9： matrix metalloproteinase一9 图 1 两种细胞 MMP-9表达情况 Fig，1 Expression of MMP-9(matrix metalloproteinase一9)in 2 NPC cell lines．A：CNE1；B：CNE1一GL(SP×200) l 2 3 删 9 圈 图2 Western blot法检测三种细胞 MMP．9的表达情况 Fig，2 Expression of MMP一9(matrix metalloproteinase一9)in 3 NPC cell lines using W estern blot analysis： l，CNE1一GL； 2，CNE2Z；3．CNE1 2．2 细胞 -基质粘附实验结果 将与 Matrigel粘着的细胞用结晶紫染色后酶标 仪测定其吸光度值，结果 CNE1一GL细胞平均吸光度 值为 1．2508±0．071 1，与 CNE1细胞的平均吸光度值 0．9519±0．068相比，差异有显著性(P<0．001)。 2．3 细胞运动实验结果 将游离的聚乙烯吡咯烷酮膜 (polyvinyl pyrroli— done，free，PVP—F)取下，在显微镜下记数细胞运动实 验中穿过 PVP—F膜的细胞数 (见图 3)，穿过PVP—F 膜的 CNE1-GL细胞数为 123．667±5．508，而 CNE1 细胞数为 55．667±5．044，两者之间差异有显著性 (P <0．001)。 2．4 肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验结果 在显微镜下记数穿过 PVP—F膜的细胞数 (见图 4)，穿过 PVP—F膜的 CNE1一GL细胞数为 339．O0± 35．84，而 CNE1细胞数为 157．67±23．18，两者之间 有显著性差异(P<0．O1)。 维普资讯 http://www.cqvip.com 484 苟新敏，等．EBV—LMP1对鼻咽癌细胞系CNE I细胞转移相关因塞 墅堕 图 3 图 4 Fig．3 Fig．4 ， l’ 3B CNE1细胞(A)和 CNE1一GL细胞(B)在运动实验中穿过 PVP-F膜的情况(SP ×200) CNE1细胞(A)和 CNE1．GL细胞(B)在侵袭实验中穿过 PVP-F膜的情况(SP×200) CNE1 cells(A)and CNE1一GL cells(B)pass through PVP．F membrane in migration assay(SP×200) CNE1 cells(A)and CNE1一GL cells(B)pass through PVP-F membrane in invasion assay(SP×200) 3 讨 论 转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征，包括肿 瘤细胞浸润周围正常组织，进入淋巴管 、血管或体 腔，运行 ，停驻 ，继续生长形成与原发瘤性质相同 的肿瘤这样一个连续的过程。肿瘤细胞脱离原发 灶进入血管 、淋巴管需要破坏细胞外基质(extracell matrix，ECM)成分及基底膜 (basement membrane， BM)来实现。基底膜是细胞外基质的重要成分之 一 ， 主要位于上皮细胞及血管的最外层，是上皮与 深层基质之间的一道屏障。突破基底膜是肿瘤细 胞进行浸润及转移的最初和最关键阶段，而基底 膜正是 MMP一9的主要底物，MMP一9与多种恶性肿 瘤的侵袭和转移呈正相关。许多研究提示 ，肿瘤侵 袭转移的能力与其产生或诱导产生 MMPs的能力 密切相关 1。 1998年 Yoshizaki等[6,71证实 LMP1在C33A细胞 中可通过 NF—B、AP一1诱导 MMP一9的表达。2002年 我国学者王承兴等 实验证实，在鼻咽癌细胞系中 LMP1也可通过 NF—KB、AP一1促进 MMP一9的表达。 本实验将转染了 LMP1基因的 CNE1一GL细胞及对 照组 CNE1细胞分 别进行 SP免疫组 化染 色和 Western blot法 检测 ，都发 现 CNE1一GL细胞 中 MMP一9的表达明显高于 CNE1细胞，提示 LMP1能 够促进 CNE1细胞中 MMP一9的表达，与报道相符。 本实验还应用细胞 一基质粘附实验 、细胞运动实验 和重组基底膜侵袭实验来检测与 CNE1．GL细胞转 移能力相关的一些指标 ，发现 LMP1可以增强 CNE1细胞与基底膜成分的粘附能力 、运动能力及 侵袭能力。LMP1可能是通过调节 CNE1细胞表面 的一些粘附分子的表达使得 CNE1细胞的粘附力 发生改变 ，并且可能通过诱导 MMP一9的表达促进 CNE1细胞降解基底膜 ，使得 CNE1细胞的侵袭能 力增加。 鼻咽癌是一种特殊的肿瘤，具有高转移特性，这 可能与 EBV—LMP1有关。本实验证实，EBV—LMP1可 增加鼻咽癌细胞中MMP一9的表达且可增强鼻咽癌 细胞与基底膜的粘附能力、运动能力及侵袭能力。再 门 维普资讯 http://www.cqvip.com 苟新敏 ，等 ．EBV—LMP1对鼻咽癌细胞系 CNE1细胞转移相关因素的影响 485 次提示 LMP1不仅具有转化潜能，还参与转移过程， 为临床防治鼻咽癌提供实验依据。 【参 考 文 献】 【1] Teramoto N，Maeda A，Kobeyashi K、et a1．Epstein-Barr virus infection to Epstein--Barr virus--negative nasopharyngeal carcinoma cell line TWO3 enhances its tumorigenicity【J]． Lab lnvest， 2000，80：303—312． 【2】 王承兴，邓锡云，李小艳 ，等 ．EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系 中通过 NF．KB、AP．1促进 MMP-9表达 【J]．中华肿瘤杂志， 2002，24：9—13． 【3] Maeta H，Ohgi S，Terada T，et a1．Protein expression of matrix metalloproteinase 2 and 9 and tissue carcinomas【J]．Virchows Arch．2001，438： 121— 128． 陈 燕，陈小毅 ．EBV—LMP1对鼻咽癌细胞系 CNE1细胞凋 亡的影响【J]．癌症，2002，2l(5)：498—503． Stetker Stevenson W G， Liotta LA， Kleiner DE， et a1． Extracellular matrix 6： role of matrix metalloproteinase in tumor invasion and metastasis【J]．FASEB J，1993，7：1434—1441． Yoshizaki T， Sato H， Furu kawa M ， et a1． The expression of matrix metalloproteinase 9 is enhanced by Epstein-Barr virus latent membrane protein l【J]．Proc Natl Sci USA，1998，95： 362l一3626． Takeshita H． Yoshizaki T， Miller W E， et a1． Matrix Metalloproteinase 9 Expression Is Induced by Epstein—Barr Virus Latent Membrane Protein l C-Terminal Activation Regions l and 2【J]．J Virol，1999，73(7)：5548—5555． 【编辑：杨允贵；校对：刘玮] 2003年全国环境 ·基因与健康学术论坛第一轮征文通知 由中国环境诱变剂学会主办的第十一届学术会议(环境 ·基因与健康学术论坛)将于 2003年 l0月在四川省成都 市(具体时间、地点第二轮再通知)召开。现将有关征文事宜通知如下： 1．大会主：环境 ·基因与健康 2．大会专题：① 21世纪遗传毒理学与疾病预防；②基因组学与环境医学的发展；③环境因素与肿瘤等疾病的 交互作用；④系统生物学与癌变、畸变 、突变 ；⑤生物工程产品的安全评价。 3．征文 要求 来稿请按 《癌变 ·畸变 ·突变》2003年第 1期的 “稿约”格式撰写 ，字数控制在 4 00以内，需附 300～400 字的中、英文摘要，全文及摘要各一份 ；或交 500—800字的大摘要一份；首页加盖单位公章 ，来稿采用 Word格式 打印并同时寄软盘。文责 自负并请 自留底稿。 4．征文截止时间：2003年 9月 10日(以当地曲戳为准)。 5．征文投稿地址： 邮政编码：100083 北京市海淀区学院路 38号 北京大学公共卫生学院营养与食品卫生学系 李 勇(收) 来稿请在信封上注明 “征文”字样。 6．优秀论文评选 ： 在被录用的论文中，评选优秀论文并发给主办单位签发的优秀论文证书，同时刊发在 《癌变 ·畸变 ·突变》杂 志 t。 中国环境诱变剂学会 { l 】 ] ] 维普资讯 http://www.cqvip.com