人促血液血管细胞生成素对内皮细胞粘附功能的影响

中 国 医 学 科 学 院 学 报 AC IlA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE 人促血液血管细胞生成素对内皮细胞粘附功能的影响△ 王晓静，刘拥军，卢士红，梁琳慧，王 晗，韩忠朝# (中国医学科学院 中国协和医科大学 血液学研究所实验血液学国家重点实验室 细胞产品国家工程研究所 泰达生命科技中心，天津300020) · 论 著 · 摘要：目的 研究人促血液血管细胞生成素 (HAPO)对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)粘附功能的影响。方法 采用结晶紫粘附实验、流式细胞术和半定量 RT-PCR方法检测 HUVEC的粘附性和粘附分子 CD54、CD102、CD106、 CD31、CD62E和 CD62P的表达。结果 HAPO以剂量依赖性方式增加 HUVEC的总粘附性。HAPO能显著促进 HUVEC 表面粘附分子CD106和 CD62E表达，并呈时间依赖性。HAPO作用 HUVEC 6 h后，CD106和CD62E的阳性率分别为 (80．83±2．22)％和 (22．77±2．59)％，是各自对照组的2．10倍和5．84倍，且转录水平和蛋白质水平一致。CD106和 CD62E的最高转录水平分别为对照组的1．86倍和6．16倍。结论 HAPO可能对造血干／祖细胞归巢有一定促进作用。 关键词：人促血液血管细胞生成素；粘附分子；内皮细胞 中图分类号：R331．1；R392．1 文献标识码：A 文章编号：1000-503X(2006)03-0364-04 Hemangiopoiet in Modulates Adhesive Properties of Endothelial Cells△ WANG Xiao-jing，LIU Yong-jun，LU Shi-hong，LIANG Lin-hui，WANG Han，HAN Zhong-chao (State Key Laboratory of ExperimentaI Hematology，National Engineering Research Center of Cell Products，Tianjin Economic—Technological Development Area Life and Technology Research Center，Institute of Hematology，CAMS and PUMC，Tianjin 300020，China) ABSTRACT：Objective To explore the effect of hemangiopoietin(HAPO)on the adhesive properties of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)．Methods The adhesion of HUVEC and the expressions of CD54，CD102，CD106，CD31，CD62E，and CD62P were measured by adhesion assay，flow c~ometry， and semi．quantitative RT．PCR．Results HAPO enhan ced the total adherence of HUVEC in a concentration． dependent manner． Flow c)rt0metry analysis revealed that the treatment of HAPO resulted in a significantly in- creased expression of CD106 and CD62E on HUVEC in a time．dependent manner．When HUVEC were incuba． ted with HAP0 for 6 h．the percentage of CD106 HUVEC and CD62E HUVEC increased about 2．10 folds and 5．84 folds，respectively，compared with contro1． I'he time-course of adhesive molecules mRNA expression indicated that the expression of CD106 and CI)62E reached at the m~imum 1．86 folds and 6．16 folds．respec． tively，compared with contro1．Conclusion HAPO may facilitate the homing of hematopoietic stem／progenitor cells． Key words：hemangiopoietin；adhesion molecule；endothelial cell ActaAcadMed Sin，2006，28(3)：364 —367 人促血液血管细胞生成素 (hemangiopoietin， HAPO)是一种新的细胞因子，HAPO基因同源性分 析表明，该因子是蛋白多糖 4基因的一种新的剪接 体 ¨ 。功能研究发现，HAPO在体外能明显刺激人 △基金项目：国家自然科学基金 (30300186)和天津市自然科学基金 (043607211)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (30300186)and the Natural Sciences Foundation of Tianjin(043607211)；#Corresponding author Tel：022-27317276，Fax：022-27317273，E-mail： tihzehan@public．tpt．tj．ca 364 June．2006 维普资讯 http://www.cqvip.com 人促血液血管细胞生成素对内皮细胞粘附功能的影响 骨髓细胞和人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)增殖，主要作用于人 造血和血管内皮干／祖细胞的早期阶段，是一种早 期生长因子。HAPO还可以拮抗人巨核细胞白血病 细胞系 MO7e去除因子诱发的凋亡。体内研究发 现，HAPO具有放射防护作用，能明显提高经同位 素亚致死量照射小鼠的存活率，加速造血功能恢 复 。除恢复造血功能外，HAPO的其他功能尚不 清楚。本研究采用原代培养的HUVEC模型，探讨 了HAPO对内皮细胞粘附功能的影响。 材料和方法 HUVEC的分离和培养 新鲜脐带采自天津中 心妇产医院。用 0．25％胰酶／EDTA充盈整根脐带， 37~C消化 15 min后，收集消化液中的细胞，悬浮于 含20％胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 U／ml链 霉素和0．3 mg／ml谷氨酰胺的M199(GIBCO)培养 液中，接种于 0．2％明胶包被 的塑料培养瓶 中， 37~C、5％CO：饱和湿度培养箱培养。待细胞融合后 用0．15％胰酶／EDTA消化传代。用第 2代 HUVEC 进行实验，实验前用含5％胎牛血清的培养液饥饿 培养 10 h。 结晶紫粘附实验 HUVEC按每孔5×10 细胞／ 100 l接种于0．5％BSA／PBS包被的96孔板中，分 别于 50、200、500、1 000和 2 000 ng／ml的 HAPO 37℃孵育 1 h，用酶标仪 (SLT，Austria)测定546 nm波长的OD值 J。以不含HAPO的培养液作为阴 性对照。 流式细胞术 500 ng／ml的HAPO与 HUVEC分 别孵育 1、2、4和6 h后，检测粘附分子的表达， 并以不含 HAPO的培养液作为对照组，单色标记 6 种粘附分子。选用的单克隆抗体为抗 CD54．PE、 CD106-PE、 CD3 1．PE、 CD102．FITC、 CD62P．FITC 和 CD62E抗体。以FITC标记的大鼠抗小鼠抗体作 为二抗，以PE或 FITC标记的小鼠同型抗体 IgG，作 为阴性对照。除 CD102-FITC抗体购自IQ公司外， 其余抗体均购自BD公司。 半定量 RT-PCR 500 ng／ml的 HAPO分别作用 HUVEC 1、2、4、8、12和 24 h后 ，用 Trizol(In— vitrogen)提取细胞总 RNA，取 2 g RNA进行逆转 录反应，以 13-actin为内参照，进行半定量 RT．PCR 检测。以不含 HAPO的培养液作为对照组。PCR反 应的引物序列见表 1。PCR反应总体系为50 l，包 括 MgCl2 1．5 mmol／L，1×PCR缓冲液，dNTP 0．5 mmol／L，目的基因或内参照基因上、下游引物各 0．3 I~mol／L，eDNA 1 Ixl，Taq DNA合成 酶 2 u。 CD54、CD102、CD62E和 B-actin的扩增条件：94℃ 预变性5 min后进入22个循环 (94℃变性30 8，60oC 退火60 8，72oC延伸60 8)，最后72℃延伸 7 min； CD106、CD31和 13-actin的扩增条件：94~C预变性5 min后进入 22个循 环 (94℃变性 30 8，58oC退火 60 8，72oC延伸60 8)，最后 72℃延伸7 min；CD62E 和13一actin的扩增条件：94~C预变性5 min后进入30 或22个循环 (94℃变性 30 8，50oC退火60 8，72oC 延伸60 8)，最后 72℃延伸7 min。 表 1 粘附分子引物序列 Table 1 Primes sequences of adhesive molecules Vo1．28 № ．3 365 维普资讯 http://www.cqvip.com 中 国 医 学 科 学 院 学 报 统计学处理 采用 SPSSIO．0统计分析软件，多 样本均数的比较采用方差分析，两样本间的比较采 用配对t检验，P<0．05表示有统计学意义。 结 果 内皮细胞鉴定 倒置显微镜下培养的原代细胞 呈菱形或多角形，贴壁成团生长，汇合成片后呈鹅 卵石样排列。为进一步确定这些细胞是否为内皮细 胞，消化第2代细胞，用内皮细胞特异性抗体 CD31 和vWF标记，流式细胞术检测 CD31和vwF的阳性 率分别大于95％和80％。因此认为这些细胞是 HU- VEC，以下实验均选用第2代 HUVEC。 HUVEC粘附性 HAPO以剂量依赖性方式增加 HUVEC的粘附性，当HAPO浓度为 1 000 ng／ml时达 到平台。当 HAPO浓度为 0、50、200、500、1 000 和2 000 ng／ml时，HUVEC的粘附性分别为 100％、 (174．4±30．9)％ 、(250．0±32．1)％ 、(31 1．8± 35．9)％ 、 (405．6±30．7)％和 (400．4±33．6)％。 不同浓度 HAPO下 HUVEC的粘附性显著高于空白对 照组 (n=6，P<0．05)。根据此结果 ，选择 500 rig／ ml浓度的 HAPO用于以下实验。 I-IAPO对 HINEC粘附分子表达的影响 对照组 HUVEC表面 CD54、CD102和 CD31分子表达阳性率 高，CD106分子表达较弱，而 CD62E和 CD62P几乎不 表达。HAPO刺激后，CD106和 CD62E的表达明显增 高，与对照组相比差异有显著性 (P<0．01)；CD54、 CD102、CD31和 CD62P的表达增加不明显 (图 1)。 12O 10o 8O ：60 差40 2O O 500 rig／ml HAPO可以增加 HUVEC表面 CD106 和CD62E的表达，并呈时间依赖性。HAPO作用 1、 2、4和 6 h后 CD106的阳性率分别为 (28．12± 5．51)％ 、(30．49±4．94)％ 、 (41．99±9．79)％和 (80．83±2．22)％，分别为对照组阳性率的1．34倍、 1．39倍、1．72倍和2．10倍，HAPO作用2、4和6 h 后CD106的表达显著高于对照组 (P<0．01)。HA． PO作用1、2、4和 6 h后，CD62E的阳性率分别为 (2．22±0．24)％ 、(4．1 1±1．98)％ 、(12．01± 2．91)％和 (22．77±2．59)％，分别为对照组阳性 率的 1．1 1倍、1．98倍、4．75倍和 5．84倍，HAPO 作用4和6 h后 CD62E的表达显著高于对照组 (P< 0．01)。 HAPO对HUVEC粘附分子 mRNA表达的影响 HAPO能增加 HUVEC CD54、CD106和 CD62E mR． NA的表达。CD54 mRNA的表达 1 h时明显升高，8 h 达峰值；CD106 mRNA的表达2 h时明显升高，4 h 达峰值；CD62E mRNA的表达2 h时明显升高，4 h 达峰值；CD54、CD106和CD62E mRNA的峰值表达 量分别是对照组的 2．09倍、1．86倍和 6．16倍 (JP <0．05，图2)。而 HAPO刺激前后 CD102、CD31、 膜结合型和可溶型 CD62P的 mRNA表达水平差异无 显著性 (P>0．05)。 CD54 446bp 13一actin 217 bp CD106 531 bp 13一actin 217 bp CD62E 509bp B—actin 217 bp Control 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24h 图2 500 ng／ml HAPO作用不同时间后 HUVEC的 CD54、 CD106和CD62E mRNA表达 Fig 2 Expression of CD54，CD106，and CD62E mRNA in HU— VEC incubated with 500 ng／ml HAPO at indicated times 讨 论 图 - ⋯ ⋯ 眦 c h 周 em 血 ato 中 po e tic c st 11 表面粘附分子的表达 “ ， ，修但 ， l、，司皿 n 乙牙 。月。腿 ¨ Fig 1 Flow cytometry of adhesive molecules on seiMm—starved 皮，向骨髓迁移的过程称为归巢。归巢是一个多步 HUVEC(，l 3-5)incubated with 500 ng／ml HAPO fo 骤过程 ，涉及到 HSPC和骨髓内皮细胞 (b0ne mamw