ACL7000全自动凝血分析仪SOP

ACL7000 全自动凝血仪 标 准 操 作 程 序 部分凝血活酶时间（APTT）测定（散射比浊法） 1.原理及检验目的 原理：将试剂加入抗凝血浆中，试剂中的微粒硅胶是血小板因子 3的面活性剂，与牛脑磷脂一同作用于内源凝血系统，当加入CaCl2 后，开始凝集，产生纤维蛋白血凝块，通过 660nm光照射血浆，测定 其凝固过程中 90o散射光变化，确定血液凝固时间，来测定APTT。 目的：由于凝血机制障碍、肝脏疾病、Vit K 缺乏或某些药物所 致凝血因子 II,V,VIII,IX,XI,XII 缺乏和肝素抗凝治疗时，可用 APTT 检测。 2.标本要求 2.1 使用血浆，9份静脉血加 1份 3.8g/dL(129mmol/L)枸掾酸钠 抗凝。 2.2 全血贮存在 4~10oC不超过 2小时，最好在 1小时内分离血浆， 采用 2000~2500rmp，离心 30min分离，以去除全血中的血小板第三因 子（PF3）, 血小板第三因子（PF4）等。此血浆在室温 22~24oC下可 存放 2 小时，在 2~4oC可存放 4 小时，在-20oC可存放 2 周，在-70oC 可存放 6个月。 冷冻血浆融化时，应将盛血浆的容器置 37oC水浴中，并轻轻摇动， 使其迅速融化，以免凝血因子消耗。冷冻过的标本不能再次冷冻，否 则结果不准确。 2.3 根据 NCCLS 规定，溶血标本易激活凝血因子，所以不应该测 定。 3.试剂 3.1 每个试剂均购自美国贝克曼库尔特公司。 1）APTT 测定试剂盒（代号 P/N:如 8468710，参见实际选用的 APTT 试剂盒） 冻干脑磷脂 5 瓶 CaCl2 5 瓶(25mmol/L) 2）定标血浆 Calibration Plasma（代号 P/N:8467300） 3）正常质控血浆 Normal control plasma（代号 P/N:8467011） 4）低水平质控血浆 Abnormal control plasma level I/Low（代 号 P/N:8467500） 5）高水平质控血浆 Abnormal control plasma level II/High （代号 P/N:8467700） 6）因子稀释液（代号 P/N:9757600） 3.2 试剂准备 用 9mL NCCLS II型或相同质量的蒸馏水溶解 1 瓶冻干脑磷脂，盖 上盖子，轻摇至完全溶解，置 15-25oC30 分钟，用前摇匀，勿用力振 摇。 3.3 试剂保存 未开封的试剂可保存在 2-8 oC至试剂盒上标明的有效期。 脑磷脂：试剂溶解后，于原瓶中 2-8 oC，7 天内有效；在ACL7000 上 （15oC），8小时有效。 CaCl2 ：于原瓶中 2-8 oC，30 天内有效。 建议试剂不使用时，最好将其倒回原瓶中，保存于 2-8 oC，不 要将试剂冷冻。 4.仪器和校准 4.1 使用美国贝克曼库尔特公司的 ACL7000 全自动血凝仪 4.2 操作步骤 第１步．在主菜单下选择 Analysis (分析) 第２步．选择 Single test session (实验模式) 选择 APTT 实验 第３步．选择Ｅnter/Edit Sample ID 键（编辑样本号）位置 １ 编辑 样本号 按对钩保存 第４步．选择 Store Loadlist 键 (保存目录) 出现对话框在框 内填写 第几批量 按对钩保存 第５步．检查 R2 放 APTT 试剂 R8 放 CACL 第６步．按 Start 键开始分析 关于比率计算方式，更多的细节请参阅 ACL7000 操作手册第四章 （比率调节）。 如果样本凝集少于空白时间，或 FIB 值低于 60mg/dl，则显示 “COAG ERROR”（凝集错误），不显示结果。如果样本在限定的最长 时间内没有凝集，则显示“NOT COAG”（没凝集），不显示结果。（见 ACL7000 操作手册第四章 SPECIAL PROGRAMS-ACQUISITION TIME，特 殊程序中的数据收集时间）。 如果分析盘上带的定标血浆（N.P.）的值在规定的范围内，则病人结 果以秒数和比率表示。 如果分析盘上带的定标血浆（N.P.）的值超过参比血浆的值的±15% （秒数），则 N.P.的值显示并以背光显示，病人样本的 APTT 值仅以 秒数表示。 屏幕上“RESULT”后出现“？”。 如果分析盘上未放 N.P.，则结果只出现秒数。 操作 按“←”，回主菜单 在“结果”画面上，按“STOP”键，在 5秒之内按 ENTER，仪器就不 会把 N.P.值存入 S.P.（即使 N.P.值在规定的范围内）。 如果 N.P.值超限，则以背光显示 5.质量控制 完整的质量控制，应用正常、高值、低值 3个水平的质控物进行质量 控制，每个均应建立自己的质控均值和 SD 值以检测实验质量。 至少每 8 小时做一次质控分析。用 Westgard 等方法进行质控数据的 分析和处理，评定质量情况。请参考 ACL7000 全自动血凝仪操作手册。 6.计算 系统自动计算结果。 7.参考值 APTT 秒：25~37 R 值：0.8~1.2 建议每个实验室应根据NCCLS(C28-A)推荐的方法（均值±2SD）建立自 己的参考值范围。 8.实验性能 8.1 精密度（批内） Normal Abn low/levI Abn high/levII Mean 32.7 55.9 78.5 CV% 0.89 0.78 1.20 8.2 相关性 斜率 截距 r 参考方法 APTT 0.902 6.386 0.946 Sllica based APTT on ACL 8.3 影响因素 8.4.1 多种药物可影响 APTT 结果，如出现异常结果，需做进一步实 验以确定导致异常的原因。 8.4.2 血浆中下列物质低于指定浓度时对结果无影响。 游离血红蛋白 胆红素 甘油三脂 APTT 100mg/dl 15mg/dl 700mg/dl 8.4.3 溶血标本不能测定。 9.参考文献 ACL7000 Operation Manual, Application Manual &Reagent Kit insert sheet of Becman Coulter Inc. 抗凝血酶（AT）测定（发色底物法） 1.原理与检测目的 原理：在待测血浆中加入过量的凝血酶，凝血酶与血浆中的 AT 形 成 1:1 的复合物，剩余的凝血酶作用于显色肽 S2765，裂解出显色基 团对硝基苯胺(pNA)，用 405nm 测吸光度，显色程度与剩余凝血酶的 量成正相关，而与血浆 AT 的量呈负相关。 检测目的：可用于排除或诊断有血栓形成倾向的患者是否患有 AT 遗传性缺乏、术前筛查、口服避孕药下医嘱之前的筛查、DIC、肾 病综合症、肝脏疾病、和用肝素或抗凝血酶浓缩液治疗的监测。 2.标本要求 2.1 使用血浆，9份静脉血加 1份 3.8g/dL(129mmol/L)枸掾酸钠抗 凝。 2.2 全血贮存在 4~10oC不超过 2小时，最好在 1小时内分离血浆， 采用 2000~2500rmp，离心 30min分离，以去除全血中的血小板第三因 子（PF3）, 血小板第三因子（PF4）等。此血浆在室温 22~24oC下可 存放 2 小时，在 2~4oC可存放 4 小时，在-20oC可存放 2 周，在-70oC 可存放 6个月。 冷冻血浆融化时，应将盛血浆的容器置 37oC水浴中，并轻轻摇动， 使其迅速融化，以免凝血因子消耗。冷冻过的标本不能再次冷冻，否 则结果不准确。 3.试剂 3.1 每个试剂均购自美国贝克曼库尔特公司。 1）AT 测定试剂盒（代号 P/N:20008900） 冻干发色底物 S2765 2 瓶（6mg/瓶） 冻干活化X因子试剂（包括牛活化X因子、肝素、缓冲液、牛血 清白蛋白） 2 瓶 2）定标血浆 Calibration Plasma（代号 P/N:8467300） 3）正常质控血浆 Normal control plasma（代号 P/N:8467011） 4）异常水平发色底物法质控血浆 Abnormal chromogenic control plasma level I/II（代号 P/N:8467600） 5）Cleaning agent（代号 P/N:9832700） 6）Cleaning solution（代号 P/N:9831700） 3.2 试剂准备 发色底物：用 2mL NCCLS II型或相同质量的蒸馏水溶解 1 瓶冻干发 色底物，盖上盖子，轻摇至完全溶解，置 15-25oC30 分钟，用前摇匀， 勿用力振摇。 活化X因子试剂：用 2.5mL NCCLS II型或相同质量的蒸馏水溶解 1瓶 冻干活化X因子试剂，盖上盖子，轻摇至完全溶解，置 15-25oC30 分 钟，用前摇匀，勿用力振摇。 3.3 试剂保存 未开封的试剂可保存在 2-8 oC至试剂盒上标明的有效期。 试剂溶解后，于原瓶中 15 oC ，7 天内有效；2-8 oC，3 月内有 效；-20 oC，6 月内有效。 建议试剂不使用时，最好将其倒回原瓶中，保存于 2-8 oC，不 要将试剂冷冻。 4.仪器和校准 4.1 使用美国贝克曼库尔特公司的 ACL7000 全自动血凝仪 4.2 操作步骤 从主屏幕上可以选择 TESTS 试验（单个试验的批量测试）或 PROFILE 组合试验。然后可以根据屏幕提示进行操作，也可以根据这 里的操作步骤说明进行实验。 注：这里只介绍选择 TESTS 试验的操作步骤，如要通过 PROFILE 组合 试验进行测试，请参见 ACL7000 操作手册。 操作 按“↑、↓、←、→”键移动光标 APTT，然后按“ENTER”键 “Check”画面出现 状态 提示放置可使用的比色盘 操作 检查是否放置了可使用的比色盘 状态 提示检查脑磷脂试剂水平 操作 标有 APTT 的大试剂杯，将脑磷脂试剂倒入放入 2号位置 状态 提示检查 CaCL2 水平 操作 标有 CaCL2 的大试剂杯，将 CaCL2 试剂倒入放入 3号位置 状态 提示检查参比液水平 操作 确保有足够的参比液，否则更换新瓶。（每 1.5-2cm 高度参比 液可做 1到 2个比色盘,包括死体积） 放上样本架, N.P.放在“POOL”的位置上，可放 18 个样本，然后按 “↓”开始分析 取样 取样臂吸取 N.P.和脑磷脂放入比色盘。然后活化最后加 CaCL2 孵育， 比色（收集数据） 状态 收集数据结束后，“results”（结果）画面出现 APTT 结果以秒数和比率表示（如果样本架上放置了 N.P.而且 N.P.值 没有背光显示） 关于比率计算方式，更多的细节请参阅 ACL7000 操作手册第四章（比 率调节）。 如果样本凝集少于空白时间，或 FIB 值低于 60mg/dl，则显示“COAG ERROR”（凝集错误），不显示结果。如果样本在限定的最长时间内没 有凝集，则显示“NOT COAG”（没凝集），不显示结果。（见 ACL7000 操作手册第四章 SPECIAL PROGRAMS-ACQUISITION TIME，特殊程序中 的数据收集时间）。 如果分析盘上带的定标血浆（N.P.）的值在规定的范围内，则病人结 果以秒数和比率表示。 如果分析盘上带的定标血浆（N.P.）的值超过参比血浆的值的±15% （秒数），则 N.P.的值显示并以背光显示，病人样本的 APTT 值仅以 秒数表示。 屏幕上“RESULT”后出现“？”。 如果分析盘上未放 N.P.，则结果只出现秒数。 操作 按“←”，回主菜单 在“结果”画面上，按“STOP”键，在 5秒之内按 ENTER，仪器就不 会把 N.P.值存入 S.P.（即使 N.P.值在规定的范围内）。 如果 N.P.值超限，则以背光显示 5.质量控制 完整的质量控制，应用正常、高值、低值 3个水平的质控物进行质量 控制，每个实验室均应建立自己的质控均值和 SD 值以检测实验质量。 至少每 8 小时做一次质控分析。用 Westgard 等方法进行质控数据的 分析和处理，评定质量情况。请参考 ACL7000 全自动血凝仪操作手册。 6.计算 系统自动计算结果。 7.参考值 75-122% 建议每个实验室应根据NCCLS(C28-A)推荐的方法（均值±2SD）建立自 己的参考值范围。 8.实验性能 8.1 精密度（批内） Mean 49.2 103.7 CV% 3.6 1.6 8.2 相关性 斜率 截距 r 参考方法 ACL7000 0.96 -1.20 0.992 COAMATIC® Antithrombin, Chromogenix AB 8.3 影响因素 血浆中下列物质低于指定浓度时对结果无影响。 肝素（UF/LMW） α1 抗胰岛素 α2 巨球蛋白 肝素辅因子 II 2U/mL 2mg/mL 7mg/mL 3IU/mL 血红蛋白 胆红素 甘油三脂 200mg/dl 20mg/dl 1000mg/dl 9.参考文献 ACL7000 Operation Manual, Application Manual &Reagent Kit insert sheet of Becman Coulter Inc. D-二聚体测定（免疫比浊法） 1.原理及检验目的 血浆中的 D-二聚体与包被在乳胶颗粒上的 D-二聚体的单克隆抗 体作用，乳胶颗粒开始凝集，凝集程度直接反映了血浆中的 D-二聚 体浓度，由 405nm 光源检测由于凝集造成的透射光变化（免疫比浊 法）。 D-二聚体是由纤维蛋白的纤溶产物进一步形成的交联纤维蛋白降 解产物。D-二聚体的特异性抗原，在纤维蛋白原及其降解产物，以及 可溶的纤维蛋白中都不存在，所以 D-二聚体为纤维蛋白的特异性降 解产物，并反映了纤溶进行的程度。 D-二聚体广泛应用于血栓疾病的诊断和溶栓治疗的监测。其水平 升高多见于深静脉血栓（DVT）、肺栓塞（PE）、弥散性血管内凝血（DIC）， 另外，妊娠时 D-二聚体也有升高，但很高的 D-二聚体水平则预示办 由并发症，如先兆子痫。 2.标本要求 2.1 使用血浆，9份静脉血加 1份 3.8g/dL(129mmol/L)枸掾酸钠抗凝。 2.2 全血贮存在 4~10oC不超过 2小时，最好在 1小时内分离血浆，采 用 2000~2500rmp，离心 30min分离，以去除全血中的血小板第三因子 （PF3）, 血小板第三因子（PF4）等。此血浆在室温 22~24oC下可存 放 2小时，在 2~4oC可存放 4小时，在-20oC可存放 2周，在-70oC可存 放 6个月。 冷冻血浆融化时，应将盛血浆的容器置 37oC水浴中，并轻轻摇 动，使其迅速融化，以免凝血因子消耗。冷冻过的标本不能再次冷冻， 否则结果不准确。 2.3 溶血标本不应该测定 3.试剂 3.1 每个试剂均购自美国贝克曼库尔特公司。 1）D-二聚体测定试剂盒（代号 P/N:20008500） Latex reagent: 包裹有 D-二聚体 单克隆抗体的冻干乳胶颗 粒 3mL X4 瓶 D-Dimer buffer:缓冲液（含牛血清蛋白和稳定剂） 9mL X3 瓶 D-Dimer calibration plasma:冻干 D-二聚体校准品 1mL X2 瓶 2）D-二聚体质控（代号 P/N:20008600） 3）因子稀释液（代号 P/N:09757600） 3.2 试剂准备 Latex reagent：用 3mL NCCLS II型或相同质量的蒸馏水溶解 1 瓶试剂，盖上盖子，轻摇至完全溶解，置 15-25oC30 分钟，用前摇匀， 勿用力振摇。 D-Dimer buffer：用前颠倒混匀。 D-Dimer calibration plasma：用 1mL NCCLS II型或相同质量 的蒸馏水溶解 1 瓶试剂，盖上盖子，轻摇至完全溶解，置 15-25oC30 分钟，用前摇匀，勿用力振摇，以避免形成泡沫。 3.3 试剂保存 未开封的试剂可保存在 2-8 oC至试剂盒上标明的有效期。 Latex reagent：试剂溶解后，于原瓶中 2-8 oC，1 个月有效； 在ACL7000 上（15oC），1天有效；勿冷冻。 D-Dimer buffer：于原瓶中 2-8 oC，1 个月有效；在ACL7000 上 （15oC），1天有效。 D-Dimer calibration plasma：试剂溶解后，15-25oC，1 个月 有效；于原瓶中， -20oC，2 个月有效。 冷冻的试剂化冻时需放在 37oC，用前轻轻摇匀，忌反复冻融。 4.仪器和操作 4.1 使用美国贝克曼库尔特公司的 ACL7000 全自动血凝仪 4.2 操作和校准（定标） 4.2.1 校准（定标）步骤 从主屏幕上，按“↑、↓、←、→”键移动光标，选择“ABS. TESTS”， 在选择“D-Dimer”，按“ENTER”键 出现“check”画面 状态 提示放入可使用的比色盘 操作 检查是否放入了可使用的比色盘 状态 检查 1号试剂位 Latex reagent 水平 操作 将 Latex reagent 倒入试剂杯，放入 1号位置 状态 提示检查参比液的水平 操作 检查是否有足够的参比液，否则请更换新瓶。（每 1.5~2cm 高 度参比液可做到 1到 2个比色盘,包括死体积） 按“↑”，启动定标 状态 显示 D-Dimer 定标状况，如试剂批号 操作 可输入新的值，按“ENTER”键 状态 “PLACE”画面出现 操作 在这个画面操作者需要输入 D-Dimer calibration plasma 的 值，ng/ml。光标显示在这个值上（默认值：1000）。按“ENTER”键 注： 这个值应该在 950~1050 ng/ml 之间，否则输入的值不会被仪器接受， 光标仍停留在这个值上。 根据操作者输入的这个值，仪器作出定标曲线和相关稀释度。 操作 按如下在样品盘上放置试剂和样品杯： -将 D-Dimer calibration plasma 放“POOL”位置； -放空杯在 17 和 18 号位； -放 D-Dimer buffer 在“DIL”位（用 4mL 杯）； -放因子稀释液在 16 号位； 按“↓”开始定标分析 状态 数据收集结束后，屏幕显示定标曲线的三个点（1000-500-250， 每个点重复 4 次），以ng/ml、光密度表示，并显示每个点的CV%，以 及曲线的相关参数m, q, r2。 如 CV%超出预设的以下范围，该值将以背光显示： NP (100%) CV%=4 NP (50%) CV%=6 NP (25%) CV%=10 状态 如果不只一个点或第 1点的数据超限，不出现“结果”画面， 屏幕显示如下： —“NOT CALBRATED： NO 1ST POINT”（未定标，无第一点） —“NOT CALBRATED： INSUFFICIENT DATA”（未定标，缺数据） —“NOT CALBRATED： SLOPE OUT OF RANGE”（未定标，斜率超限） 操作 按“PRT”键，可以打印定标数据 按“↑”，显示定标曲线 操作 按“PRT”打印定标曲线 按“←”接受或拒绝定标结果 按“ENTER”键，接受并储存。 按“↑”，不接受 4.2.2 样品操作步骤 从主屏幕上，按“↑、↓、←、→”键移动光标，选择“ABS. TESTS”， 在选择“D-Dimer”，按“ENTER”键 出现“check”画面 状态 提示放入可使用的比色盘 操作 检查是否放入了可使用的比色盘 状态 检查 1号试剂位 Latex reagent 水平 操作 将 Latex reagent 倒入试剂杯，放入 1号位置 状态 提示检查参比液的水平 操作 检查是否有足够的参比液，否则请更换新瓶。（每 1.5~2cm 高 度参比液可做到 1到 2个比色盘,包括死体积） 操作 放 D-Dimer buffer 在“DIL”位； 样品从样品盘 1号位开始放置。 在 check 画面，按“↓”开始分析。 接下来，开始加样、孵育、收集数据，之后出现结果画面。 操作 按“PRT”打印结果 按“<=”回 ABS、菜单 样品结果超出 1050ng/ml，可以 1：5 稀释样品后（50ul 血浆+200ul 因子稀释液）再测。 5.质量控制 应用高值、低值 2个水平的质控物进行质量控制，每个实验室均应建 立自己的质控均值和 SD 值以检测实验质量。请参考 ACL7000 全自动 血凝仪操作手册。 6.计算 系统自动计算结果。 7.参考值 测定 240 例健康献血者的正常上限值为 255ng/ml。 建议每个实验室建立自己的参考值。 8.实验性能 8.1 线性范围 200-1050ng/ml，超出 1050ng/ml，可以 1：5稀释样品， <20000ng/ml 无前带现象。 8.2 精密度 批内 平均值（ng/ml） 310 732 1055 CV% 6.01 2.42 1.31 8.3 相关性 斜率 截距 r 参考方法 ACL7000 1.26 240.4 0.998 D-Dimertest EIA(酶免法) 8.4 影响因素 8.4.1 血浆中下列物质低于指定浓度时对 D-二聚体结果无影响。 血红蛋白 胆红素 甘油三脂 FDP 风湿因子 50mg/dl 5mg/dl 1000mg/dl 20ug/ml 60IU/ml 8.4.2 溶血标本不能测定。 9.参考文献 ACL7000 Operation Manual, Application Manual &Reagent Kit insert sheet of Becman Coulter Inc. 纤维蛋白原-Clauss（FIB-C）测定（散射比浊法） 1.原理及检验目的 原理：将试剂加入稀释的抗凝血浆中，试剂中过量的牛凝血酶可直 接作用血浆中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，此反应过程的速率即反 映了纤维蛋白原的浓度和功能。通过 660nm 光照射血浆，测定其凝固 反应的散射浊度变化。 目的：在血液凝固过程中，几种先天性的纤维蛋白原异常可影响纤 维蛋白原转化为纤维蛋白。纤维蛋白原是评价诸如弥散性血管内凝血 （DIC）、肝脏疾病、炎症及肿瘤的有效指标，纤维蛋白原水平升高反 映病人患心血管疾病的风险增加，还可见于妊娠及口服避孕药等。而 纤栓治疗时纤维蛋白原水平会降低。 2.标本要求 2.1 使用血浆，9份静脉血加 1份 3.8g/dL(129mmol/L)枸掾酸钠抗凝。 2.2 全血贮存在 4~10oC不超过 2小时，最好在 1小时内分离血浆，采 用 2000~2500rmp，离心 30min分离，以去除全血中的血小板第三因子 （PF3）, 血小板第三因子（PF4）等。此血浆在室温 22~24oC下可存 放 2小时，在 2~4oC可存放 4小时，在-20oC可存放 2周，在-70oC可存 放 6个月。 冷冻血浆融化时，应将盛血浆的容器置 37oC水浴中，并轻轻摇 动，使其迅速融化，以免凝血因子消耗。冷冻过的标本不能再次冷冻， 否则结果不准确。 2.3 根据 NCCLS 规定，溶血标本易激活凝血因子，所以不应该测定。 3.试剂 3.1 每个试剂均购自美国贝克曼库尔特公司。 1）FIB-C 测定试剂盒（代号 P/N:8469110） 冻干牛凝血酶（>35uNIH/ml） 8 瓶 异常质控血浆 2 瓶 2）定标血浆 Calibration Plasma（代号 P/N:8467300） 3）正常质控血浆 Normal control plasma（代号 P/N:8467011） 4）低纤维蛋白原质控血浆 Low fibrinogen control （ 代 号 P/N:20004200） 5）因子稀释液（代号 P/N:9757600） 6）清洗液 A Cleaning solution（代号 P/N:9831700） 7）清洗液 B Cleaning agent（代号 P/N:9832700） 3.2 试剂准备 牛凝血酶：用 2mL NCCLS II型或相同质量的蒸馏水溶解 1 瓶牛凝血 酶，盖上盖子，轻摇至完全溶解，置 15-25oC 30 分钟，用前摇匀， 勿用力振摇。 异常质控血浆：用 1mL NCCLS II型或相同质量的蒸馏水溶解 1 瓶血 浆，盖上盖子，轻摇至完全溶解，置 15-25oC 30 分钟，用前摇匀， 勿用力振摇。 3.3 试剂保存 未开封的试剂可保存在 2-8 oC至试剂盒上标明的有效期。 试剂溶解后， 凝血酶：于原瓶中 2-8 oC，3 天内有效；于原瓶中-20 oC，1 个月有效； ACL（15oC），3小时有效。 异常质控血浆：于原瓶中，15-25oC，4 小时有效；-20 oC，7 天有效。 建议试剂不使用时，最好将其倒回原瓶中，保存于 2-8 oC。 4.仪器和校准 4.1 使用美国贝克曼库尔特公司的 ACL7000 全自动血凝仪 4.2 操作步骤 可以根据屏幕提示进行操作，也可以根据这里的操作步骤说明进行实 验。 4.2.1 校准（定标）步骤 选择Ｃalibration 程序 选择 Calibrate 菜单弹出Ｃalibration 选择右侧 TEST FIB-C 定标 A1 放 NP A2 放因子稀释液 按 START 键分析 状态 数据收集结束后，屏幕显示定标曲线的三个点，以 mg/dL（或 g/L）和秒数表示，平均值+CV+曲线系数，例： 如果输入的 N.P.值是 300mg/dl，则定标曲线的值如下： —450mg/dl（150% N.P.） —300mg/dl（100% N.P.） —150mg/dl（50% N.P.） 操作 按“↑”显示定标数据，按“←”接受或拒绝定标结果 状态 如果超过一个点的数据超限，不出现“结果”画面，屏幕显示 如下： —“NOT CALBRATED： NO 1ST POINT”（未定标，无第一点） —“NOT CALBRATED： INSUFFICIENT DATA”（未定标，缺数据） —“NOT CALBRATED： SLOPE OUT OF RANGE”（未定标，斜率超限） 操作 按“PRT”键，可以打印定标数据 按“↑”，显示定标曲线 操作 按“PRT”打印定标曲线 按“←”接受或拒绝定标结果 按“ENTER”键，接受考验并储存。 按“↑”，不接受 4.2.2 样品操作步骤 第１步．在主菜单下选择 Analysis (分析) 第２步．选择 Single test session (实验模式) 选择 FIB-C 实验 第３步．选择Ｅnter/Edit Sample ID 键（编辑样本号）位置 １ 编辑 样本号 按对钩保存 第４步．选择 Store Loadlist 键 (保存目录) 出现对话框在框 内填写 第几批量 按对钩保存 第５步．检查 R3 放 FIB-C 试剂 第６步．按 Start 键开始分析前，必须执行清洗程序。 附加清洗程序主要是为了洗掉取样针上附着的凝血酶，避免遗留到下 一次分析中。 5.质量控制 完整的质量控制，应用正常及异常质控物进行质量控制，每个实验室 均应建立自己的质控均值和 SD 值以检测实验质量。至少每 8 小时做 一次质控分析。用 Westgard 等方法进行质控数据的分析和处理，评 定质量情况。请参考 ACL7000 全自动血凝仪操作手册。 6.计算 系统自动计算结果。 7.参考值 230-500mg/dL 建议每个实验室应根据NCCLS(C28-A)推荐的方法（均值±2SD）建立自 己的参考值范围。 8.实验性能 8.1 精密度（批内） Mean(mg/dl) 102 303 441 CV% 2.2 2.2 1.8 8.2 相关性 斜率 截距 r 参考方法 0.94 -9.73 0.978 FIB Clauss 8.3 线性 70-750mg/dl 8.4 影响因素 8.4.1 血浆中下列物质低于指定浓度时对结果无影响。 游离血红蛋白 胆红素 甘油三脂 肝素 150mg/dl 20mg/dl 1022mg/dl 1U/ml FDP（纤维蛋白及纤维蛋白原降解产物），对 FIB-C 有影响。 8.4.2 溶血标本不能测定。 9.参考文献 ACL7000 Operation Manual, Application Manual &Reagent Kit insert sheet of Becman Coulter Inc. 凝血酶原时间-纤维蛋白原（PT-FIB）测定（散射比浊法） 1.原理及检验目的 本实验可同时测定凝血酶原时间（PT）和纤维蛋白原（FIB）浓 度。 原理：将组织凝血活酶、钙离子加入抗凝血浆中，激活外源凝血 途径，产生纤维蛋白血凝块，通过 660nm光照射血浆，测定其凝固过 程中 90o散射光变化，确定血液凝固时间，来测定PT。 在检测 PT 的同时，血浆浊度的变化与血浆中 FIB 的含量成正相 关，通过测定凝固终点和起始点光散射强度的差值，再根据试验前已 经做出的由不同已知 FIB 浓度与相应的光散射差值关系的标准曲线 即可推测出 FIB 的浓度。 目的：用来评估患者外源凝血途径功能，进行外源凝血因子测定， 尤其适用于口服抗凝剂治疗（OAT）。 2.标本要求 2.1 使用血浆，9份静脉血加 1份 3.8g/dL(129mmol/L)枸掾酸钠抗凝。 2.2 全血贮存在 4~10oC不超过 2小时，最好在 1小时内分离血浆，采 用 2000~2500rmp，离心 30min分离，以去除全血中的血小板第三因子 （PF3）, 血小板第三因子（PF4）等。此血浆在室温 22~24oC下可存 放 2小时，在 2~4oC可存放 4小时，在-20oC可存放 2周，在-70oC可存 放 6个月。 冷冻血浆融化时，应将盛血浆的容器置 37oC水浴中，并轻轻摇 动，使其迅速融化，以免凝血因子消耗。冷冻过的标本不能再次冷冻， 否则结果不准确。 2.3 根据 NCCLS 规定，溶血标本易激活凝血因子，所以不应该测定。 3.试剂 3.1 每个试剂均购自美国贝克曼库尔特公司。 1）PT-FIB测定试剂盒（代号P/N:如84688210，参见实际选用的PT-FIB 试剂盒） 兔脑促凝血激酶 10mL X8 瓶 2）定标血浆 Calibration Plasma（代号 P/N:8467300） 3）样品稀释液（代号 P/N:9756800） 4）因子稀释液（代号 P/N:9757600） 5）正常质控血浆 Normal control plasma（代号 P/N:8467011） 6）低水平质控血浆 Abnormal control plasma level I/Low（代号 P/N:8467500） 7）高水平质控血浆 Abnormal control plasma level II/High（代 号 P/N:8467700） 8）低纤维蛋白原质控物 Low Fibrinogen control （ 代 号 P/N:20004200） 注：促凝血酶原激酶 当用不同的促凝血酶原激酶，或用不同的检测方法（手工、半自 动、全自动）做 PT 测试时，其秒数结果将会有较显著的差异。而对 于口服抗凝药的病人来说，需要一个能进行比较的 PT 结果。 国际血液血标准委员会（ICSH）及国际血栓与止血委员会（ICTH） 建议，根据试剂的 ISI 值（国际敏感度指数）计算 INR 值（国际标准 化比值），并以 INR 值作为 PT 的通用结果。 根据经验及文献报道，试剂的灵敏度一手测试方法及机器自动化 程度的影响。但美国贝克曼库尔特公司提供的 PT-FIB 试剂，每一批 号都经过了严格的测试，与 ICSH 及 ICTH 的参考品有很好的相关性， 其 ISI 值均注明在试剂盒说明书中。在 ACL7000 上，当输入试剂的 ISI 值后，机器会自动给出 INR 值。 INR=(PT Ratio) ISI 3.2 试剂准备 用 3mL NCCLS II型或相同质量的蒸馏水溶解 1 瓶促凝血激酶，盖上 盖子，轻摇至完全溶解，置 15-25oC30 分钟，用前摇匀，勿用力振摇。 3.3 试剂保存 未开封的试剂可保存在 2-8 oC至试剂盒上标明的有效期。 试剂溶解后，于原瓶中 2-8 oC，3 天内有效；在ACL7000 上（15oC）， 8小时有效。 建议试剂不使用时，最好将其倒回原瓶中，保存于 2-8 oC。 4.仪器和校准 4.1 使用美国贝克曼库尔特公司的 ACL7000 全自动血凝仪 4.2 操作步骤 从主屏幕上可以选择 TESTS 试验（单个试验的批量测试）或 PROFILE 组合试验。然后可以根据屏幕提示进行操作，也可以根据这 里的操作步骤说明进行实验。 注：这里只介绍选择 TESTS 试验的操作步骤，如要通过 PROFILE 组合 试验进行测试，请参见 ACL7000 操作手册。 1）按“↑、↓、←、→”移动光标，选择 PT-FIB，然后按“ENTER” 键。“Check”画面出现。 2）检查比色池内是否放置了可使用的比色盘 3） 将凝血活酶试剂（PT 试剂）倒入试剂杯（大号），标好 PT-FIB 放入 1号位置 4）确保参比液有足够的量（1.5-2cm 高度的参比液可做到 1 到 2 个 比色盘,包括死体积）如果剩下的参比液不足量,请换上一瓶新的。 5） 如果仪器已定标,显示 CAL DATA（see PROG）提示注意定标数 据。 如果出现“NOT CALIBRATED”，表示 PT—FIB 没有定标。 4.2.1 校准（定标）步骤 选择Ｃalibration 程序 选择 Calibrate 菜单弹出Ｃalibration 选择Ｌiquid 按键 选择ＰＴ－ＨＳ填写ＩＳＩ值 见ＰＴ－ＨＳ说明书 选择ＮＰ 填写 ＦＩＢ值 见ＮＰ说明书（ＮＰ－定标血浆） 按对钩保存 请按说明书输入定标血浆的值，输入的定标血浆的 FIB 值，仪 器可接受的范围在 200~450mg/dl 之间。如果 FIB 的值输入的是零， 仪器将不对 FIB 定标。 注： ISI 值可接受的范围在 0.1~9.999。（参照所用的凝血活酶说明书） 操作 按“ENTER”键确定输入的数据。（按“ENTER”键后，才可以 输入下一个数据） 状态 输入所有的数据后，仪器提示操作者按屏幕显示放置正常血浆 和稀释液。（定标时，在“A1”和“A2”位置上都请使用 2ml 杯子） 操作 请将定标血浆（2ml）放在“A1”位置，样本稀释液（2ml）放 在“A2”位置上 按 START 操作 检查样本盘，放入新比色盘 仪器自动稀释定标 注意：在液面感受器检查完毕前，不要取走样本架和试剂杯，否则循 环将被中止。 在定标结束后“定标结果”画面出现 状态 定标结果以下列形式表示：用秒数表示：6个 100%定标血浆的 平均值，6个 50%定标血浆的平均值，6个 25%定标血浆的平均值，还 有和每次稀释过程相关的 CV 值。同时显示相关系数（γ2） 注： PT—FIB 定标是由于 100%，50%，25%。这三个水平的定标血浆的各 6 次测定的平均值决定的。 下面是可能出现的定标值错误： a） 如果在计算平均值时，少于 4个重复点值（其他 2个值超过范 围，未凝或凝集错误）则显示“NOT CALIBRATED”。 b）如果每个浓度平均值的 CV 值超过预设定的范围，那么这个 CV 被 打上黑框。PT 和 FIB 的预设范围如下： PT Fibrinogen NP（100%） CV﹤1.5% CV﹤8.0% NP（50%） CV﹤2.0% CV﹤12.0% NP（25%） CV﹤2.0% CV﹤12.0% b） 如果γ2超过预设定范围（0.980），则被打上黑框 c） 如果γ2和 CV 都超限了，都被打上黑框 d） 在操作者按下接受键之前，任何定标结果都不被存储 —在 PT，FIB 定标中，如果 CV 值打黑框了，但 CV 少于或等于上表给 出的范围（1.0%），而且γ2 在范围内，则此定标结果可被接受。如 果γ2打黑框，则必须重新定标。 操作 如果在“calibration results”画面按下“↑”，仪器显示 PT 的定标曲线、斜率（m）、截距（q）和γ2 操作 按“PRT”键打印 PT 的定标曲线和 m，q，γ2 然后按“←”继续存储定标结果。 现在可以选择接受或不接受定标结果 操作 按“←”接受定标结果 按“PRT”键结果打印定标结果 状态 仪器请操作者再次确认接受标结果 操作 按“ENTER”键盘来确定 操作 在可选择接受或不接受定标结果的那个画面，按“↑”是不接 受定标结果 4.2.2 样品操作步骤 第１步．在主菜单下选择 Analysis (分析) 第２步．选择 Single test session (实验模式) 选择 PT-FIB 实验 第３步．选择Ｅnter/Edit Sample ID 键（编辑样本号）位置 １ 编辑 样本号 按对钩保存 第４步．选择 Store Loadlist 键 (保存目录) 出现对话框在框 内填写 第几批量 按对钩保存 第５步．按 Start 键开始分析 计算： 如果仪器已经定标 —如样本盘上放置了定标血浆，则 PT 的结果用秒数，活动度和比率 ／INR 表示，FIB 用 mg/dl 或 g/l 表示； —如果标本盘上未放置定标血浆，则 PT 的结果只用秒数表示，且无 FIB 值（Autocal PT 选择“”打开） 如果仪器没有定标： —如果样本盘上放置了定标血浆，则 PT 的结果用秒数、活动度和比 率/INR 表示（Autocal PT 选择“ON”打开），无 FIB 值。 —如果样本盘上未放置定标血浆，则 PT 的结果只用秒数表明，无 FIB 值。 注： 自动计算： PT 结果的计算，可以选择两种方式： 1） 选“ON—Calibration Plasma”（每次的 N.P.值打开），仪器 计算时，选用每次测定的 N.P.值（秒）来计算所有病人样品。（见 第四章和第七章）（N.P.为每盘样本“POOL”位置的正常血浆） 2） 选“OFF—Calibration Plasma”(每次的 N.P.值关闭),仪器 计算结果时，选用贮存的定标曲线的第一点的秒数值来计算所有 病人样品。（见第四章和第七章） 注：INR 设定程序 如果选择了 PROG，SET UP，CALCULATION，INR ON，同时凝血活酶的 ISI 值已经输入了“Calibration”画面，则结果中的比率被 INR 值 所取代（如前所述） 注(黑框)： 如果样本凝集少于空白时间，或 FIB 结果低于 60mg/dl（对于 PT/TT/APTT）则显示“COAG ERROR”（凝集错误），不显示结果。如果 样本在限定的最长时间内没有凝集，则显示“NOT COAG”（没凝集）， 不显示结果。 注：定标血浆： 在测定结果中，N.P.的实测 PT 值以秒数表示，N.P.的实测 FIB 值以 mg/dl 和 g/L 表示。 注：%—R—INR—PT 计算 在选择“AUTO CAL PT”为“ON”时，则以 N.P.的 PT 值做为分母 来计算样本的比率/INR；在选择“AUTO CAL PT”为“OFF”时，则以 定标曲线的第一个点的 PT 值为分母来计算标本的比率/INR。依据定 标曲线，病人的样本值（秒）和定标血浆或 N.P.值（秒）（根据在“AUTO CAL PT”的选择）的比率被用来求得活动度（%） 注：FIB 计算 用病人样本值（散射光差值）和定标血浆在定标曲线上的第一个点值 （散射光差值）的比率可以计算出病人样本的 FIB 值（mg/dl 或 g/L）。 注：背光显示的 PT 值。 如 N.P.的 PT 值（秒数）和 FIB 的值（mg/dl 或 g/L）在规定范围内， 可以正常的形式打印出来。如果 N.P.的 PT 值超出了定标血浆（100%） 的 PT 值的±9%范围，N.P.的 PT 值就被背光显示。病人标本的 PT 结 果则只以秒数显示出来，无%和 R/INR（见仪器定标）。 注：背光显示的 FIB 值： 当 N.P.的 FIB 值超过了定标曲线中定标血浆（100%）的 FIB 值的差 值的±20%，则 FIB 结果被背光显示。 病人样本的 FIB 值不显示（仪器定标过）。 注：结果显示“？” 如果出现“注意”或 N.P.值以背光显示，屏幕上部出现一个“？” （RESULITS？） 操作 按“←”仪器回到主菜单。 在结果屏幕上，按“STOP”，在工作上秒内按“ENTER”键，仪器就不 会把 N.P.值存入 Q.C.（即使 N.P.值在规定的范围内） 如果操作者贮存了超范围的 N.P.的数据，则数据将以背光显示。 5.质量控制 完整的质量控制，应用正常、高值、低值 3个水平的质控物进行质量 控制，每个实验室均应建立自己的质控均值和 SD 值以检测实验质量。 至少每 8 小时做一次质控分析。用 Westgard 等方法进行质控数据的 分析和处理，评定质量情况。请参考 ACL7000 全自动血凝仪操作手册。 6.计算 系统自动计算结果。 7.参考值 PT 秒：10.7~14.4 FIB：190~600mg/dL 活动度：160~80% R 值：0.8~1.1 建议每个实验室应根据NCCLS(C28-A)推荐的方法（均值±2SD）建立自 己的参考值范围。 8.实验性能 8.1FIB 线性范围 80-850ng/ml； 8.2 精密度 PT(sec) FIB(mg/dL) Normal Abn Abn Normal Low Fib low/levI low/levII Mean 13.5 29.2 46.9 253 91 CV% 1.5 3.3 2.2 4.5 5.3 8.3 相关性 斜率 截距 r 参考方法 PT 0.805 4.63 0.979 PT on ACL FIB 1.304 -53.74 0.988 FIB(Clauss) on ACL 8.4 影响因素 8.4.1 多种药物可影响 PT 结果，如出现异常结果，需做进一步实验 以确定导致异常的原因。 8.4.2 血浆中下列物质低于指定浓度时对结果无影响。 游离血红蛋白 胆红素 甘油三脂 肝 素 PT 100mg/dl 15mg/dl 700mg/dl 0.5U/ml FIB 100mg/dl 15mg/dl 700mg/dl 1.0U/ml FDP 对 PT-FIB 的影响比对 FIB-Clauss 法小。 8.4.3 溶血标本不能测定。 9.OAT（口服抗凝药）的治疗范围 INR 值范围 INR 值 1）术前 2周开始的 OAT 非髋部外科 1.5-2.5 2 髋部外科 2-3 2.5 2）静脉血栓的一二级防护 2-3 2.5 3）活动性静脉血栓、非栓塞和预防血栓 复发 2-4 3 4）预防动脉栓塞包括心脏换瓣术后 3-4.5 3.5 10.参考文献 ACL7000 Operation Manual, Application Manual &Reagent Kit insert sheet of Becman Coulter Inc. 凝血酶时间（TT）测定（散射比浊法） 1.原理及检验目的 原理：将试剂加入抗凝血浆中，试剂中的牛凝血酶可直接作用血浆 中的纤维蛋白原生成纤维蛋白凝块，通过 660nm光照射血浆，测定其 凝固过程中 90o散射光变化，确定血液凝固时间，来测定TT。 目的：监测弥散性血管内凝血（DIC）、肝素治疗、纤维蛋白原数量 及质量异常、纤溶活性增强等。 2.标本要求 2.1 使用血浆，9份静脉血加 1份 3.8g/dL(129mmol/L)枸掾酸钠抗凝。 2.2 全血贮存在 4~10oC不超过 2小时，最好在 1小时内分离血浆，采 用 2000~2500rmp，离心 30min分离，以去除全血中的血小板第三因子 （PF