单克隆抗体（一）

null 生物制药技术之—— 单克隆抗体技术 讲师：朱海燕 生物合成教研室 2008-04 生物制药技术之—— 单克隆抗体技术 讲师：朱海燕 生物合成教研室 2008-04 null 三代抗体 第一代抗体:多克隆抗体 第二代抗体:单克隆抗体 第三代抗体:基因工程抗体 nullnullnullnull淋巴细胞T 淋巴因子（干扰素） 细胞免疫B 抗体 体液免疫 null(轻链)(重链) 抗原抗原一、抗体的结构和功能null 可变区（variable region, V区） 位于L链靠近N端的1/2和H链靠近N端的1/5或1/4区域。 VH、VL VH、VL中某些局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为超变区（hypervariable region,HVR）,为抗原与抗体结合的位置。 恒定区（constant region, C区） 位于L链靠近C端的1/2和H链靠近C端的3/4或4/5区域。 CH、CL nullIgG分子由两条H链和两条L链共价结合而成。轻链包括VL和CL两个结构域，重链含有1个VH和3个CH 结构域。VH和VL共同组成抗原结合部位。Ig分子中线对称，具有两个相同的抗原结合部位。nullnullVLCLCHVH FabFcnull 1、一个抗体分子包括两个完全相同的重链分子（H）和两个完全相同的轻链分子（L），V区结合抗原，C区执行生物学功能。 2、用木瓜蛋白酶处理可将抗体分解为3个部分，即两个Fab片段和个Fc片段： Fab：保存与抗原结合的活性和特异性 Fc：抗体结合抗原后激活机体免疫反应的主要部位，与Fc受体结合后，激发不同的效应功能。包括： 调理促吞噬作用；介导过敏反应；抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。 null 多克隆抗体：由于一个抗原通常都有几个抗原决定簇，因此每个免疫细胞都可能产生一种针对某一抗原决定簇（antigenic determinant）的抗体，这些由同一抗原产生的不同抗体统称为多克隆抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibodies，PcAb） 单克隆抗体：单一类型的只针对某一抗原决定簇的抗体分子，是由单一的B淋巴细胞克隆产生的结构和特异性完全相同的高纯度抗体 什么叫McAb? 什么叫McAb? 从一个B淋巴细胞克隆产生的抗体。B淋巴细胞杂交瘤是由骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合发展而成的一种细胞。识别抗原分子上某一特定抗原决定簇的抗体，称单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb ) ，简称单抗。因此McAb 在结构上是均一的。 nullnull 单克隆抗体的优点： ①单一特异性，与一个抗原决定簇反应； ② 可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂； ③一经制出，可大量地供应； ④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原； ⑤灵敏性高，能查出混合物中存在的用常规查不出的少量成分。null 如何获得McAb?如何大量获得McAb?需要克服哪些技术问题？null 理想的抗体分泌细胞： 具有合成和分泌抗体的能力, 具有大量无限生长的特性， 。 null 1975年8月7日，Kohler和Milstein在Nature上发表了一篇报道,题为Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.(Nature 1975;256:495) “可分泌预定特异性抗体的融合细胞的持续培养” 。这一文献已成为一篇经典的文献, 对生物学和医学领域中的基础和应用研究有着深远的意义。为此,Kohler和Milstein 获得了1984年诺贝尔医学生理学奖。这一技术上的突破, 在制造和使用抗体方面开创了一个新纪元。所以 McAb 被称为第二代抗体。 null 1975年,英国剑桥大学分子生物学研究室的Kohler和Milstein首先应用绵羊红细胞免疫小鼠的脾细胞与多发性骨髓瘤细胞株(P3X63-Ag8)混合,加入仙台病毒,进行融合后, 在选择性培养基HAT上克隆再克隆, 得到单株无性繁殖杂交瘤细胞系。在培养液的上清中或接种到小鼠腹腔的腹水中,含有高度专一的，能在单个抗原中决定簇水平上选择Ag的特异性抗体.这种Ab系由单株系细胞所产生,因此称为McAb。 null 细胞融合 ——杂交瘤细胞（hybridoma） 骨髓瘤细胞： HGPRT-（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型） 1992年Milstein用8-氮杂鸟嘌呤(8-azaguanine)诱导而成 TK-（胸腺嘧啶脱氧核苷激酶缺陷型） 脾细胞 应来自相同种系 免疫后脾脏分离淋巴细胞 对抗原特异的B淋巴细胞比较少，影响融合效率 富集方法 null 杂交瘤细胞的选择 HAT培养基（次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶) H, Hypoxanthin次黄嘌呤; A, Aminopterin氨基喋呤； T, Thymidine胸腺嘧啶核苷。 核酸合成途径： 全合成途径（被叶酸拮抗剂氨基蝶呤阻断） 补救途径（关键酶为次黄嘌呤磷酸核糖转移酶） 补救途径补救途径 次黄嘌呤 次黄嘌呤-5 磷酸 次黄嘌呤 磷酸核糖转移酶HGPRTHGPRT-补救途径null磷酸-5-核糖PRPP (5-磷酸核糖焦磷酸）ATP谷酰胺PRA（5-磷酸核糖胺）GAR甘氨酰胺-核苷酸THFAF-GAR(甲酰甘氨酰胺-核苷酸）AIR氨基咪唑核苷酸AICAR(氨基咪唑-4甲酸-核苷酸）THFA F-AICAR甲酰氨基咪唑-氨甲酰-核苷酸IMP次黄嘌呤核苷酸SAMP腺嘌呤-琥珀酰-核苷酸AMP腺嘌呤核苷酸XMP黄嘌呤核苷酸GMP鸟嘌呤核苷酸 核苷酸的合成核苷酸的合成(从无到有)核苷酸的合成(从无到有)甘氨酰胺核苷酸甲酰甘氨酰胺核苷酸 THFA5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸 THFA5-甲酰胺-4-氨甲酰咪唑核苷酸次黄嘌呤核苷酸氨基蝶呤为THFA阻断剂nullnull 融合剂 病毒（病毒神经氨酸酶降解细胞膜上的糖蛋白） 聚乙二醇（PEG，融合率较仙台病毒高数百倍） 电融合技术PEG 的作用机制PEG 的作用机制 PEG 可以使细胞聚积在一起,当PEG 的浓度达50%时,PEG 可能与邻近膜的水分相结合,使细胞之间只有几个埃的空间的水分被取代,由此,降低细胞表面的极性,导致脂双层不稳定,引起细胞膜的融合.nullA HGPRT- （骨髓瘤细胞）B HGPRT+ （脾细胞）BBBAAAAB 不能在HAT 培养基上生长能在HAT培养基 上生长不能增殖null 一株好的小鼠骨髓瘤细胞株应具备如下几个特点： 1）稳定，易培养 2）自身不分泌免疫球蛋白 3）融合率高 4）是HGPRT缺陷株，便于用HAT培养基筛选 目前我国最常用的骨髓瘤细胞株：NS-1或Sp2/0null杂交瘤技术的优缺点 优点： 1）几乎能获得引起小鼠免疫反应的任何抗原或抗体 2）有利于特异性杂交瘤的富集 3）可长期传代并保存 4）抗体结构高度均一，具有高度特异性 5）有利于杂交瘤细胞保持亲本细胞的抗体分泌优势 6）可由未纯化抗原制备纯质抗体 7）该技术使抗体成为一种可以按需制备并且灵活运用的试剂 8）合成抗体易于用同位素标记 9）使一个正常细胞的功能得以“永存”null 缺点： 1）融合率低 2）一些杂交瘤细胞在抗体分泌上显得不稳定 3）尚需要建立范围更广泛、符合各种细胞融合要求的骨 髓瘤细胞系。null三、单克隆抗体的制备抗原动物免疫B细胞骨髓瘤细胞系融合杂交瘤筛选小鼠腹腔接种收集腹水提取抗体细胞培养,大量制备抗体nullnull利用杂交瘤细胞系生产单克隆抗体抗原和免疫 抗原 免疫 动物选择：Balb/c小鼠 品系一致 途径 体内、体外null克隆化与再克隆化 克隆：由单个细胞繁殖扩增而形成性状均一的细胞集落的过程 目的：确保杂交瘤细胞所分泌的抗体具有单克隆性以及从细胞群中筛选出具有稳定表现型。null（1）有限稀释技术 柏松分布 （2）半固体琼脂培养法 0.5%琼脂培养 基中 进行克隆 1ml含不同数量的细胞悬液 1ml42度0.5%的琼脂液混匀涂于培养皿（含20%血清的0.5%琼脂培养基）37度，5%CO2培养箱，培养一周转移至96孔板检查上清分泌抗体情况null 单克隆抗体的检测 1、单克隆抗体活性检测 酶联免疫吸附实验（ELISA） 放免测定（RIA） FAC（荧光激活细胞分选仪，流式培养仪） IFA（间接免疫荧光法） null 2、杂交瘤染色体 3、Ig 亚类分析鉴定 ① 先分析Ig类型,IgG,A,M ② 再分析亚类,IgG1,IgG2a,IgG2b 4、单克隆抗体纯度鉴定 nullnullnull 1. 包被已知抗原: Ag要纯, Ag 越纯，特异性越高。 蛋白浓度1-10ug/ml. 每孔加0.2mL,4℃过夜. PBST 洗 3 次 x5’; 封闭10%小牛血清. 37℃30min. PBST 洗 3x5’。 加培养上清 37℃ 2h. PBST 洗 3x5’。 注意加阳性对照，阴性对照。 4 .加酶标记二抗(兔抗鼠) 37℃ 2h PBST 洗3x5’。 null 5. 加底物显色. 6. 加终止剂 2M H2SO4, 50uL 测OD值 判定结果: 阴性孔应无色或接近无色. 阳性孔明显显色. OPD-棕红色 测定孔OD ≥2倍以上, 判定为阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏程序性降温液氮冻存法 原则:慢冻快苏 null 五、杂交瘤单抗的大量制备 ①  动物腹水制备 ②  静止培养 细胞悬浮培养 固定化培养 六 McAb的纯化六 McAb的纯化 盐析 DEAE 凝胶过滤 亲和层析(protein A)null七 单克隆抗体应用 1、单克隆抗体靶向制剂 1）药物与单抗直接偶联 2）药物通过小分子与单抗连接 3）药物通过大分子与单抗相连 2、肿瘤的导向治疗 nullnull免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicin ARicin ASPDP: N-琥珀酰胺基-3-丙酸nullnull 3、 单克隆抗体与新型诊断技术 体内微量成分和药物的测定 癌症诊断 传染病诊断 蛇毒诊断 体内定位诊断 放射免疫显影技术：是对肿瘤及其转移灶或复发灶进行定位或定性诊断的无创伤新技术null思考题： 1、抗体的基本结构和功能 2、多克隆抗体、单克隆抗体的概念，单克隆抗体的主要特点 3、利用杂交瘤细胞系生产单克隆抗体的基本过程 4、利用HAT培养基选择杂交瘤细胞的原理 5、杂交瘤克隆 6、单克隆抗体靶向制剂的制备方法，举例说明单克隆抗体靶向制剂在疾病治疗领域中的应用。