单克隆抗体(二)

null单克隆抗体技术(二)单克隆抗体技术(二)null 人单克隆抗体的制备null 通过传统的杂交瘤技术是很难获得人源单克隆抗体的主要原因: 1.在人-鼠淋巴细胞的融合细胞中人源的染色体通常是不稳定的,因而得到的人源单克隆抗体极少。 2.目前人们还没有找到能有效代替鼠的骨髓瘤细胞的人的骨髓瘤细胞。 3.处于理论考虑,人们无法对人进行多种抗原的免疫.null （一）EB病毒转化细胞技术 EB病毒：1964年Epistein和Barr从非洲Burkitt淋巴瘤中建立的类淋巴细胞母细胞株中发现了类似于疱疹病毒的颗粒。 病毒专家将EBV在体外使B细胞获得无限传代能力的这一过程，称为转化。 B细胞EBV转化的特征是B细胞的形态发生明显的母细胞转化，即细胞体积增大，由圆形成为具有较多伪足的多边形。 转化后的细胞能无限传代培养，增生的细胞有明显的凝集现象。 EBV核心抗原（EBNA）阳性。null EBV对成人B细胞的转化率低，仅为0.1-2×10-5 影响EBV对B细胞转化成功的因素多： ●支原体污染 ●大部分成年人均受到过EBV的感染，因而机体会发展出对EBV的免疫反应，主要是细胞免疫反应。 ●EBV转化细胞的克隆率低 ●实验操作中的EBV污染与操作人员的再感染。null （二） 人——鼠杂交瘤 人 B细胞（外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、或人脾细胞） 小鼠骨髓瘤细胞系（NS-1，p3x63Ag8.653，SP2/0） 难点：分泌的不稳定性，分泌8周到6个月。 可能与杂交瘤染色体丢失有关。null （三）人——人杂交瘤 细胞系具备的条件： 与人淋巴细胞融合可产生较高的融合率。 能产生一定量具有特异性的抗体。 产生的杂交瘤其核型应该是稳定的。 几种亲代细胞系： 人骨髓瘤细胞系——产生大量人单克隆免疫球蛋白，但核糖体少，不含有含EB病毒受体。 人B淋巴瘤——细胞株数量少，获得难。 人B淋巴母细胞系 ——由EBV转化B细胞中培养筛选出来的，EBV核心抗原阳性，但只分泌少量免疫球蛋白。 null （四）EBV转化——杂交瘤技术 人B淋巴细胞母细胞系B6（用抗破伤风类毒素的EBV转化过的） + 小鼠浆细胞瘤p3/x63-Ag8.653（不分泌+8-杂氮鸟嘌呤抵抗） 筛选培养液：HAT和10-5mol/l乌本苷 小鼠耐受浓度高为10-3mol/l乌本苷；人比较敏感为10-7mol/l乌本苷 缺点：种间杂交瘤的不稳定性nullnullEB转化-杂交瘤技术的优点 ● 可使B细胞获得永生性，可以冻存用于反复融合 ● 融合前可预先筛选出抗原特异性B细胞 ● 有较高的融合率 ● 抗体产量较高 ● 抗体分泌稳定性较好null 制备人抗的技术路线不够完善，局限性表现： 1）缺乏一株适于融合的亲代细胞系 2）医学伦理学的限制无法用任意一种抗原免疫人体 3）难以获得足够数量对抗特异的B细胞 4）融合率低（1-5×10-6） 5）杂交瘤抗体分泌稳定性差第三代抗体为基因工程抗体 （genetically engineered antibodies,GeAb） 是指用基因工程，对抗体的基因进行重组、缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表达，获得抗体。 第三代抗体为基因工程抗体 （genetically engineered antibodies,GeAb） 是指用基因工程方法，对抗体的基因进行重组、缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表达，获得抗体。 null基因工程抗体常用的表达系统 一、大肠杆菌表达系统 表达外源蛋白成本低，产量大。无糖基化能力，多用来表达抗体片段。Fv、Fab、scFv。 二、昆虫细胞表达系统 可进行N、O糖基化等蛋白质翻译后加工，并能进行胞外分泌表达。表达水平是原核细胞的50-100倍。 三、酵母表达系统 是能使表达产物糖基化并可分泌胞外的最简单真核生物。目前多采用嗜甲醇型酵母—毕赤酵母。 四、植物表达系统 五、哺乳类细胞表达系统 CHO、COS、Hela、NSO。CHO细胞已成为较成熟的稳定表达系统，该系统能正确装配、折叠与糖基化等特点，分泌水平高，易大规模生产。null 基因工程抗体技术的基本操作是首先从杂交瘤或免疫脾细胞外周血、淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中，并在适当的宿主细胞如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或转基因动物和植物中表达，并折叠成有功能的抗体分子，筛选出高表达细胞株，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。 nullIgG分子由两条H链和两条L链共价结合而成。轻链包括VL和CL两个结构域，重链含有1个VH和3个CH 结构域。VH和VL共同组成抗原结合部位。Ig分子中线对称，具有两个相同的抗原结合部位。null 1、一个抗体分子包括两个完全相同的重链分子（H）和两个完全相同的轻链分子（L），V区结合抗原，C区执行生物学功能。 2、用木瓜蛋白酶处理可将抗体分解为3个部分，即两个Fab片段和个Fc片段： Fab：保存与抗原结合的活性和特异性 Fc：抗体结合抗原后激活机体免疫反应的主要部位，与Fc受体结合后，激发不同的效应功能。包括： 调理促吞噬作用；介导过敏反应；抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。嵌合抗体原理嵌合抗体原理 根据抗体基因由多个不同功能区组成，每个功能区都位于独立外显子中的特点，人们可以对抗体基因进行重新组装。1984年由Morrison等构建的嵌合抗体（chimerican antibody) 即是第一种基因工程抗体，开创了抗体工程的先例。null （一）嵌合抗体（chimeric antibody）是用人抗体的C区替代鼠的C区，使鼠源性单抗的免疫原性明显减弱，并可延长其在体内的半衰期及改善药物的动力学，属第一代人源化抗体（humanized antibody，HAb）。抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（V），同机体免疫原性则决定于抗体分子的恒定区（C）。嵌合抗体是应用重组DNA技术从小鼠杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出抗体基因的功能性可变区，与人免疫球蛋白恒定区基因拼接后，构建成人-鼠嵌合的重链、轻链基因，再导入骨髓瘤细胞中表达。 nullnull 目前，用于治疗目的的单克隆抗体多为鼠源性单克隆抗体。鼠抗体基因与人基因的同源性较少，因此鼠源性单克隆抗体对人体具有较强的免疫原性，使用后很可能会诱发人抗鼠抗体反应。由于这种抗体反应90％是针对C区的，因此设计用人 C 区替代鼠C区，则可能使鼠源性单克隆抗体的免疫原性明显减弱。null 嵌合抗体的基本原理是从分泌某种鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性鼠IgV区基因，经基因重组与人IgC区基因按一定方式相拼接，克隆到表达载体中构建鼠/人嵌合的轻重链基因表达载体，并转入适当的宿主细胞表达,制备特异性嵌合抗体。null可变区基因的克隆 采用PCR技术克隆鼠单抗轻链可变区和重链可变区基因的方法 ● 培养亲本杂交瘤细胞，离心收集细胞，洗涤并悬浮PBS中。 ● 按方法提取并纯化RNA，保证RNA纯度合格。 ● 按标准方法从mRNA合成单链cDNA,灭活反转录酶，从RNA-cDNA杂合物中分离出单链cDNA。 ● 设计并合成合适的引物（轻链引导肽引物和重链引导肽引物） ● PCR反应，分别克隆鼠单抗的轻链可变区和重链可变区基因 ● 琼脂糖电泳鉴定，并回收PCR产物。 ● 将可变区基因克隆至质粒载体，完成表达VH和VL重组质粒的构建 ● 转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。 ● 抗体序列测定，验证目的基因。 null 这种嵌合抗体保持了亲本鼠单抗的特异性和亲和力,同时人源性的恒定区不仅少了HAMA现象,而且还能有效地介导产生补体以来的细胞毒作用(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）及免疫调理作用。 目前已有数十种嵌合抗体进入了临床试用，虽然HAMA现象较鼠单抗大为下降，但有相当比例的患者仍会出现HAMA症状，所以采用嵌合抗体用于降低HAMA效应并不理想。null 嵌合抗体在很大程度上减弱了人抗鼠抗体（HAMA）反应，但仍不能完全消除HAMA，针对可变区的抗独特型抗体反应仍很明显。 对抗体分子结构的研究发现，抗体与抗原结合的特异性和亲和力主要取决于其可变区的6个互补的CDR区。可变区的其他部分作为骨架区（FR）仅发挥支持CDR作用，与抗体功能无关。null （二）改形抗体（reshaped antibody，RAb）亦叫“重构抗体”，因其主要涉及CDR 的“移植”，又可称为“CDR移植抗体（CDR grafting antibody）”。 它是利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补性决定区（complementarity determinative region，CDR）的氨基酸序列改换成鼠源单抗CDR 序列，此种抗体可以使人单抗获得鼠单抗的特异性又保持人源抗体的亲和力。 null 在VL、VH中某些局部区域的氨基酸序列组成和排列顺序具有更高的变化程度，这些区域称为超变区（ hypervariable region,HVR）。在V区中非HVR部位的氨基酸组成和排列相对比较保守，称为骨架区（framework region）。经X射线结晶衍射的研究分析证明，超变区确实为抗体与抗原结合的位置，因而称为互补决定区（complementarity-determiniing region,CDR）。null一种人源单克隆抗体的结构null早期的改形抗体，是简单的CDR移植。 第二代改形抗体则应用了人抗体基因库、引进计算机技术 模拟抗体分子的立体结构，并且使用了人鼠嵌合的框架。 同源蛋白质结构模建技术是预测蛋白质空间结构的可靠方法之一 。 采用RT-PCR方法从分泌亲本鼠单抗的杂交瘤细胞中克隆可变区基因。 如IL-2受体改形抗体。亲和力提高30%。 null 事实上，单纯的CDR区移植并不能完全保持亲本抗体的亲和力和特异性，还需要同时构建与亲本抗体类似的骨架区结构（FR），这一点往往成为改型抗体构建的关键。因此，改型抗体比嵌合抗体的人源性程度高，但亲和力常常偏低。为了保全改型抗体的抗原结合部位的空间构象，保持亲本抗体的亲和力和特异性，构建改型抗体之前应仔细分析鼠单抗可变区的氨基酸序列，以确定那些对形成抗原结合位点很重要的氨基酸残基。null （三）小分子抗体因其分子量小、穿透性强、抗原性低，可在原核系统表达及易于基因工程操作等优点而受到人们的重视，成为基因工程抗体家族的主要成员和研究热点。目前已构建成功的小分子抗体有 Fab、 Fv、单链抗体（ScFv）段、二硫键稳定的Fab段、单域抗体（single-domain antibody）。多价小分子抗体有双链抗体（diabody）、三链抗体（triabody）、四链抗体（tetrabody）、微型抗体（minibody）等 null Fab、scFv抗体 Fab、scFv在目前的实用价值比较高，许多临床制剂均采用这两种形式。这类抗体因为相对分子质量小，易于穿透血管或组织达到靶部位，利于疾病的治疗，且不含有Fc端，不与相应受体结合，降低副反应，半衰期短，有利于毒素的中和及清除。 Fv片段是抗体的抗原结合部位。由VH和VL通过共价键结合组成，是抗体中具有完整抗原结合活性的最小功能片段，分子量只有完整分子的/6，其分子小、免疫原性弱、对实体瘤的穿透力强，所以可作为载体与药物、同位素、毒素等相结合，用于肿瘤的诊断和治疗，也可用于细胞内免疫，是基因治疗的一种/。 Fv片段是抗体的抗原结合部位。由VH和VL通过共价键结合组成，是抗体中具有完整抗原结合活性的最小功能片段，分子量只有完整分子的/6，其分子小、免疫原性弱、对实体瘤的穿透力强，所以可作为载体与药物、同位素、毒素等相结合，用于肿瘤的诊断和治疗，也可用于细胞内免疫，是基因治疗的一种方案/。 null 原理主要是借助大肠杆菌细胞壁的周质腔可提供类似内质网的环境，使所需表达的小分子抗体蛋白在细菌信号肽的引导下分泌到周质腔，等信号肽被信号酶降解后，在周质腔完成折叠、组装。 Fv是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段，由轻链可变区和重链可变区组成，以非共价键将两者结合一起,相对分子量为完整抗体的1/6。 ScFv：为了使Fv更加稳定，人们用一段4-25个氨基酸的肽链接头将VL和VH连接起来，形成单链抗体。null （四）功能化抗体 以增加抗体功能为出发点，使原本单价的抗体片段或功能单一的完整抗体成为具有特殊功能（酶切、导向）的抗体分子。一般采用基因序列上的设计、整合或者体外的连接来实现这类功能化抗体的制备，常见的功能化抗体主要有双特异性抗体、抗体融合蛋白及免疫毒素。 null 双功能抗体亦称双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）是由两个不同的抗原结合位点组成，即同一抗体的两个抗原结合部位分别针对两个不同的抗原，在结构上是双价的，但与抗原结合的功能是单价的。它实际是一种杂交分子，两条H链之间与两条L链之间的结构不同，两条Fab片段也不同。 该种抗体具有双重特异性的抗体，可以分别结合两种不同的抗原，这样便可以拥有导向功能，如应用针对效应细胞和靶目标（病毒、肿瘤细胞）的BsAb，能将效应细胞导向靶目标，发挥效应。通常用化学偶联或二次杂交瘤技术进行制备。 null 抗体融合蛋白通过改造抗体的恒定区，使抗体的一部分被具有其他特性的非抗体序列替代。如Neubergor等将DNA聚合酶Ⅰ、Klenow活性酶、金黄色葡萄球菌核酸酶替换抗体的恒定区，使抗体既有与抗原特异性结合的性能，又具备了核酸酶的活性。 免疫毒素即单克隆抗体与毒素的偶联物，它与双功能性抗体有点类似，通过抗体原有的结合位点定位肿瘤部位，然后通过毒力非常强大的细菌或植物毒素来杀死肿瘤细胞。   null 制备双特异抗体有化学偶联法.杂交瘤方法和基因工程方法. 1、偶联法可快速、大量制备双特异抗体,但在体内易被清除. 2、杂交瘤方法制备的双特异抗体生物活性高,但制备要经过融合,筛选而繁琐的步骤,耗时长,不易与其他单抗分离开. 3、基因工程方法制备的双特异抗体分子量小,易于大量制备,有广阔前途. null （五）抗体库技术制备的抗体 抗体库技术以细菌克隆B细胞克隆，利用基因工程的方法，将全套人抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过宿主大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，并经过筛选后获得特异性的抗体。这类抗体可以是完全人源化的抗体。该技术摆脱了其他基因功能抗体制备工程中不可避免的鼠源性问，成为了继单克隆技术之后抗体制备技术上的又一个里程碑。 包括组合抗体库、噬菌体抗体库和核糖体展示抗体库null噬菌体展示抗体库 噬菌体展示技术最早报道于1985年，它将外源蛋白与丝状噬菌体外壳蛋白融合，使外源蛋白表达在噬菌体颗粒表面。 其原理是将编码外壳蛋白的基因Ⅷ和基因Ⅲ与抗体基因融合表达，使表达的抗体附着在噬菌体表面，达到展示的目的，同时确保了抗体这一特定分子的基因型和表型容易在同一病毒颗粒内，即噬菌体核心DNA中含有特定蛋白分子的结构基因，并能在噬菌体表面表达该蛋白。丝状噬菌体可以识别细菌性菌毛，进而感染细菌。 nullnull 1990年 Mccafferty等证明:将Ab可变区基因插入噬菌体geneⅢ中,表达出与噬菌体衣壳蛋白的N末端相连的抗体—噬菌体融合蛋白.抗体功能片段呈现在噬菌体表面,而且能正确折叠,并能与特异性Ag结合,由于有此特性,可用抗原直接筛选基因文库中任何一种所需要的抗体,使得整套抗体的分离.生产更快更容易. null 噬菌体展示技术null从分离的淋巴细胞中提取mRNAmRNA逆转录为cDNA通过PCR扩增重链和轻链用一套特别的限制性内切酶酶解将重链序列克隆到重链 丝状噬菌体载体中将重链和轻链重组到 一个丝状噬菌体载体中用抗原结合筛选噬菌斑将轻链序列克隆到轻链 丝状噬菌体载体中在丝状噬菌体中表达抗体的过程nullnull 综上，基因型和表型的统一使噬菌体颗粒可以作为筛选特异性抗体的介质使用；而丝状噬菌体感染大肠杆菌并可大量扩增的能力又使这种特殊的介质具有可扩增性，即先通过筛选试验从数目庞大的噬菌体群中获得与目的抗原特异性结合的有限的噬菌体颗粒，然后再由感染大肠杆菌使筛选所得的有限噬菌体颗粒获得数量上的扩增，反复几次后便可获得能与目的抗原特异性结合的大量噬菌体颗粒，这也就是噬菌体展示技术筛选抗体的原理。null ScFv噬菌体抗体库的构建流程 从人外周血淋巴细胞中提取RNA，并合成cDNA以cDNA为模板，PCR扩增重链可变区（VH）片段以cDNA为模板，PCR扩增轻链可变区（LH）片段将VH片段插入噬菌体pCANTAB6PCR扩增VH库基因将LH片段插入噬粒pCANTAB3his6将连接片段基因插入含轻链基因的噬粒中PCR扩增含连接链、轻链基因的噬菌体抗体库基因组装scFv完整基因，并加以PCR扩增，将完整基因插入pCANTAB6中构成噬菌体库null 与传统的抗体制备技术相比，噬菌体抗体库技术不仅避免了耗时而繁琐的动物免疫与细胞融合过程，直接在体外进行了抗体制备，而且还能够得到一些集体处于正常状态下不易产生的抗体，如针对自身抗原及有毒的抗原的抗体。一般认为体内有10-30%的针对自身抗原的抗体因多种机制的作用无法进行反映和增殖，形成免疫耐受，但噬菌体抗体库在筛选时就没有这种限制，即利用这种技术可以轻易筛出人体内不易产生的抗体。同时细菌比细胞增殖快，培养成本低廉，利于大量制备高纯度抗体，所以噬菌体抗体库是基因工程抗体中最有前景的技术。null转基因鼠 null 1.在鼠胚胎干细胞内（ES）采用内源技术使鼠IgH 和IgK基因失活 ２.相互繁育和回交产生DI鼠（纯合子）不能产生鼠源抗体， ３.以人工酵母染色体转移系统将含有人的IgH（YH2）和IgK（YK2））的基因整合到ES细胞染色体上生成转基因小鼠 4.再将转基因小鼠YH2、YK2相互间繁育，该鼠即能生成人源和鼠源 抗体。 5. YH2、YK2鼠与DI鼠繁育且再回交即产生Xeno Mouse鼠株带有4个基因组合，整合在染色体上的YH2、YK2以及鼠IgH 和IgK失活基因。null转基因植物 植物生产抗体的优点: 1)价格低廉,可用于大规模种植。 2)外源抗体基因或片段一般都可以整合进植物的染色体中稳定遗传，因此人们只需把转基因植物进行杂交就可以向植物中导入新的抗体基因或积累多个抗体基因或片段 3)转基因植物株可以简单通过种子的形式长期保存。 4)植物细胞可以对表达的重组抗体蛋白进行正确的组装和后期加工，有助于全面发挥抗体的功能。null 分泌型IgA在植物中的组装null 在转基因植物中分别表达了部分抗体和抗体的分泌组分（SC）。 在这些转基因植物之间做了一系列的有性杂交，在最后得到的烟草植株中可以同时表达这4种蛋白，这些蛋白可以组装成一个具有功能的相对大分子质量的分泌抗体。null抗肿瘤抗体药物 一般分为两类 一、抗肿瘤的纯粹单克隆抗体，单独的抗体作用肿瘤细胞的机理一般是通过封闭与肿瘤细胞生长代谢相关的细胞因子、信号通路或通过抗体介导免疫系统杀伤肿瘤细胞，从而起到抗肿瘤的作用。 二、单抗与抗肿瘤药物的偶联物，或称免疫偶联物，是抗肿瘤药物的主要研究方向。 抗肿瘤药物——化学免疫偶联物 放射性核素——放射免疫偶联物 毒 素——免疫毒素 与游离药物相比：提高肿瘤部位的药物浓度，降低化疗药物对正常组的细胞毒性。null抗肿瘤单抗药物的靶标主要是肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原或特定的受体。 一个理想的mAb靶抗原需符合以下两个条件： 1、肿瘤细胞特异性表达或高表达的表面因子。 2、选择抗原功能应与肿瘤发生过程有关。 单抗药物与受体或特定的基因表达蛋白特异性结合，进而影响肿瘤细胞的生长代谢，达到抑制肿瘤细胞的目的。null 抗病毒抗体药物 抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)基因工程抗体药物synagis。识别RSV胞膜糖蛋白F蛋白A决定簇的人源化基因工程抗体（IgG1K MAb），含95%人源化成分，5%鼠源抗体成分。 日本乙型脑炎 单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）null抗体的放射免疫显像与疾病诊断 以放射性核素为标记物的免疫分析法，用来对相应疾病的发生和发展做出适时准确的和定位。 1992年美国FDA正式批准结肠—直肠癌或卵巢癌111In标记单抗应用于临床诊断。平均灵敏度>70%，平均特异性>80%。重组人α干扰素 单克隆抗体的研制重组人α干扰素 单克隆抗体的研制null 干扰素是细胞免疫的重要成分，目前广泛应用于病毒性肝炎、肿瘤和一些其他病毒感染的治疗中。干扰素的检测和重组人干扰素的纯化工艺均需要高质量的单克隆抗体，特别是在生产重组干扰素工艺中，单克隆抗体亲和层析是生产干扰素最重要步骤。1、杂交瘤细胞株的建立1、杂交瘤细胞株的建立纯化重组人干扰素α1ｂ（抗原）6周龄雄性BALB/c小鼠100μｇ抗原＋完全佛氏佐剂100μｇ抗原＋不完全佛氏佐剂100μｇ抗原＋不完全佛氏佐剂尾静脉注射抗原100μｇ第一次免疫第二次免疫第三次免疫加强免疫↓↓↓↓1个月后2个月后融合前3天动物免疫null无菌取脾细胞小鼠骨髓瘤细胞SP2/01:5 ~1:10混合，离心＋37℃水浴，加入预温的50%PEG，静置1.5min，滴加不完全DMEM，离心加完全DMEM接种在96孔细胞培养板中，置37℃5%CO2环境培养第2天换含1%HAT完全DMEM培养基14d后换1%HAT培养基，挑选克隆细胞融合ELISA方法检测抗体阳性克隆筛选细胞体外扩增腹腔接种BLAB/c小鼠14d后收集腹水腹水制备2、抗体的筛选2、抗体的筛选 采用ELISA方法检测细胞上清液、腹水中和抗体滴度,分别用重组人干扰素(α1ｂ、α2ｂ、α2ａ、)和重组集成干扰素、重组新型干扰素作抗原。3、抗体特异性鉴定3、抗体特异性鉴定 交叉中和试验 Westernblot试验 null4、免疫球蛋白类和亚类的鉴定 5、杂交瘤细胞染色体核型分析 6、单克隆抗体纯化 7、单克隆抗体蛋白计算 8、抗人α型干扰素亲和层析柱的制备null细胞融合、筛选和克隆　 1次细胞融合筛选到40个阳性孔。用ELISA方法检测抗体,获得5株稳定性好、高滴度的单克隆抗体。 细胞分泌抗体的稳定性结果　 经连续传代,这些细胞所分泌单克隆抗体的中和效价没有大的变化,表明杂交瘤细胞性状稳定。 免疫球蛋白和亚类的鉴定　 五株McAb均属IgG1 干扰素单克隆抗体型特异性检定 结果表明2Ｅ9、4Ｇ1只识别重组人α1ｂ型干扰素抗原,而不识别其他4种抗原。2Ｃ9识别重组新型干扰素,2Ａ7、4Ｇ10识别5种重组人α型干扰素。 抗人CTLA 4单克隆抗体的制备抗人CTLA 4单克隆抗体的制备null　 杀伤性Ｔ淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）分子是淋巴细胞表面的一种与免疫信号传递有关的配体蛋白分子，又称CD152,其前体由223个氨基酸残基构成。因此抗CTLA4抗体在肿瘤治疗和疫苗免疫作用的加强方面具有巨大的应用前景。null抗原 获得了中国人群CTLA 4基 因序列，以此表达蛋白为免疫原 动物免疫 细胞克隆、筛选及克隆化 腹水的制备及抗体的纯化 Ig类别、亚类及效价的测定 抗人CTLA-4单克隆抗体的 Westernblot检测 CTLA-4抗原决定簇的单抗识别null1. 纯化后CTLA-4抗原蛋白的鉴定 1 切胶纯化的CTLA- 4抗原 2 CTLA-4表达菌株的包涵体蛋白 3 非表达菌株的包涵体蛋白null2. 杂交瘤细胞系的建立　 取免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，融合率为75%，利用间接及夹心ELISA法筛选出对CTLA-4反应强的阳性孔细胞，用有限稀释法连续克隆阳性孔细胞3次，经检测均有阳性细胞存在。null3. 抗人CTLA-4单抗的Westernblot检测1 蛋白Marker 2 纯化的CTLA-4表达蛋白 3 空白对照菌体的包涵体蛋白null4. 抗体饱和曲线的测定