鸡新城疫诊断技术规程
1 范围
本规程引用GB16550-1996新城疫检疫技术规范。
本规程规定了新城疫群体检疫、个体检疫、实验室检验和检疫后处理的技术规范。
本规程适用于鸡和其他可感染新城疫的禽类。
2 群体检疫
对养禽场、独立饲养的禽群及外售、外运的禽群施行检疫。
2.1 查明疫病背景
通过询问兽医人员或检查疫病
,检查被检禽场(群、室)在过去的一年内是否有出现过新城疫临诊病例,是否有与新城疫接触史,周围2km范围内是否发生过新城疫。
2.2 查清免疫状况
通过查验免疫证明或查询其他
,检查被检群是否已按规定注射合格疫苗。如按规定免疫并正处于规定的保护期内,禽只健康状况良好,被认为免疫合格。如免疫不符合规定要求,要以合格疫苗再次接种,隔离饲养观察至群体抗体滴度达25以上,全群健康,认为免疫合格;观察期内发现疑似新城疫病禽,须按2.3和2.4条要求进一步检查。
2.3群体临诊检查
首先作静态检查,让禽群处于静止状态,观察营养状况、精神状态、呼吸、粪便、鼻和口腔分泌物有否异常。然后观察禽只运动状况,有否跛行、共济失调、痉挛等异常现象。检查中重点注意以下情况:
a.精神沉郁或无任何症状而死亡;
b.体温升高、食欲减退、精神委顿、产蛋减少或停止;
c.口腔和鼻腔分泌物增多,素囊胀满;
d.呼吸困难、喉部发出“咯咯“声(晚间较明显);
e.下痢,粪便成绿色;
f.偏头转颈,作转圈运动或共济失调。
若发现疑似病例,按2.4条要求进一步检查,同时对全群隔离饲养。
2.4 病理解剖检查
对临诊疑似病例,应全部或抽样解剖,依据下述病变作出初步判断:
a.口腔、喉部有粘液,咽部粘膜出血;
b.腺胃乳头肿胀,挤压后有豆腐渣样坏死物流出,乳头有散在的出血点;
c.肌胃角质下层有条纹或点状出血、有时见不规则溃疡,腺胃与肌胃交接处有出血斑、条;
D小肠前段有大面积散在出血点,或肠粘膜有纤维性坏死并形成假膜,假膜下出现红色粗糙溃疡;
E盲肠和直肠皱褶处有出血 ,盲肠扁桃体(淋巴滤泡)出血坏死;
F气管粘膜充血、出血、气管内有粘液;
G心冠脂肪、心外膜及心尖脂肪上有针尖状小出血点。
3 个体检疫
3.1在无群体检疫条件的场合,须进行个体检疫。个体检疫合格的禽只一般供食用,如继续饲养应隔离3周,经观察无异常后,方准与其它禽只混养。
3.1.1 查明是否来自疫区。
3.1.2 查验免疫证明。
3.1.3 临诊检查和病理解剖检查
检查内容参照2.3条和2.4条进行,发现疑似新城疫染疫禽只,立即作无害化处理。
4 实验室检验
4.1 下列情况进行实验室检查
a. 产地定期检疫;
b. 监测免疫状态;
c. 疑似病鸡的定性,或临诊及解剖检查初步诊断为新城疫,需进一步确诊;
d. 检疫中发现重大疫情(如禽流感),须作鉴别诊断;
e. 行政主管部门、饲养单位、售购或争议双方要求进行实验室诊断。
4.2 实验室
方法
a. 病毒分离鉴定试验,见附录A。
b. 血凝抑制试验,用于免疫监测,见附录B。
5. 检疫后的处理
5.1 经临床检查、解剖检查和实验室诊断等综合判断,确诊为新城疫的禽群或禽只,按GB16548处理。
5.2 经初步诊断为新城疫可疑的禽群(禽只),按下述方法之一处理:
a. 除将可疑禽只按5.1条处理外,全群隔离饲养,并进行紧急免疫接种,如在接种后观察期内出现可疑禽只,亦按5.1条处理,观察21天后,对临床健康,免疫滴度达到25以上的禽只,经体表消毒后按健康禽只对待。
b. 经初步诊断为新城疫可疑的禽群(禽只),在全部隔离饲养的同时,对可疑禽只采样作实验室诊断,如确为新城疫者,全群即按5.1条处理。
5.3 发生过新城疫的禽场在半年之内,其禽只不准出售、外运。
附录A 病毒分离鉴定试验
A1仪器设备
注射器:1ml。
注射针头:5—5.5号。
血凝试验板:V型、96孔。
微量移液器:50ul。
恒温箱。
超净工作台或无菌室。
A2试剂。
无菌生理盐水。
青霉素。
链霉素。
阳性血清。
A3样品采集及处理
A3.1活禽用气管拭子和泄殖腔拭子(或粪)。
A3.2死禽以脑为主;也可采心、肝、脾、肾、气囊等组织。
A3.3样品用生理盐水研成1:5乳液;拭子侵入2—3ml 生理盐水中,反复吸挤压至无水滴出,弃之。溶液中加入青霉素(使终浓度为1000单位/ ml )、链霉素(使终浓度为1mg/ml )。泄殖腔拭子(或粪)样品,青霉素、链霉素量提高5倍。然后调pH 7.0—7.4,37℃作用1h ,再1000r/分钟离心10分钟,取上清0.1ml,经尿囊腔接种9—10日龄SPF鸡胚。
A4培养物的收集及检测
A4.1培养4—7天的尿囊液经无菌采集后-20℃保存.
A4.2尿囊液按附录B作血凝试验,并与标准阳性血清作血凝抑制试验,确定有无 新城疫病毒繁殖。
A4.3MDT(最小病毒致死量引起鸡胚死亡的平均时间)的 测定:将新鲜尿囊液用生理盐水连续10倍稀释,10-6—10-9的 每个稀释度接种5个9—10日龄SPF鸡胚,每胚0.1ml,37℃孵化。余下的病毒保存于4℃,8h后 以同样方法接种第二批鸡胚,连续 7天内观察鸡胚死亡时间并记录,测定出最小致死量,即引起被接种鸡胚死亡的最大稀释倍数。计算MDT。
A4.4以MDT确定病毒的致病力强弱,40—70h死亡为强毒,140h以上为弱毒。
附录B 鸡新城疫微量红细胞凝集抑制试验
B1仪器设备
B1.1微量血凝板:V型、96孔。
B1.2微型振荡器。
B1.3塑料采血管。
B1.4移液器:50ul.
B2试剂
B2.1稀释液
pH7.0—7.2磷酸缓冲盐水
氯化钠(GB1266—77) 170g
磷酸二氢钾(GB1274—77) 13.6g
氢氧化钠(GB629—77) 3.0g
蒸馏水 1000ml
高压灭菌,4保存,使用是作20倍稀释。
B2.2浓缩抗原
B2.3 0.5%红细胞悬液
采成年鸡血,用20倍量磷酸缓冲盐水洗涤3—4次,每次以2000r/min离心3—4分钟,最后一次5分钟,用磷酸缓冲盐水配成0.5%悬液。
B2.4标准阳性血清
B3被检血清
每群鸡随机采20—30份血样,分离血清。
采血法:先用三棱针刺破翅下静脉,随即用塑料管引流血液至6~8cm长。将管一端烧融封口,待凝固析出血清后以1000r/min离心5分钟,剪断塑料管,将血清倒入一块塑料板小孔中,若需较长时间保存,可在离心后将凝血块一端剪去,滴融化石蜡封口,于0oC保存。
B4 操作方法
B4.1 微量血凝试验
B4.1.1 于微量血凝板(B1.1)的每孔中滴加稀释液(B2.1)50ul,共滴四排。
B4.1.2 吸取1:5稀释抗原滴加于第一列孔,每孔50ul,然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔,再从第11孔各吸取50ul弃之。最后一列不加抗原作对照。
B4.1.3 于每孔加入0.5%红细胞悬液(B2.3)50ul。
B4.1.4 置微型振荡器(B1.2)上振荡1分钟,或手持血凝板绕圆圈混匀。
B4.1.5 放室温下(18~20oC)30~40分钟,根据血凝图象判定结果。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排重复,以几何平均值表示结果。
B4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度,按式(B1)进行计算。
抗原应稀释倍数=血凝滴度/4……………………..(B1)
B4.2 微量血凝抑制试验
B4.2.1 先取稀释液(B2.1)50ul,加入微量血凝板(B1.1)的第一孔,再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3~12孔,每孔50ul,第二孔加浓度为8个血凝单位的抗原50ul。
B4.2.2吸被检血清(B3)50ul 于第1孔(血清对照)中,挤压混匀后吸50ul 于第2孔,依次倍比稀释至12孔,最后弃去50 ul.
B4.2.3置室温(18—20℃)下作用20分钟.
B4.2.4滴加50ul 0.5%红细胞悬液(B2.3)于各孔中,振荡混合后,室温下静置30—40分钟,判定结果
B4.2.5每次测定应设已知滴度的 标准阳性血清(B2.4)对照.
B5结果判定
B5.1在对照出现正确结果的情况下,以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度.
B5.2若有10%以上的鸡出现11(log2)以上的高血凝抑制滴度,说明鸡群已受新城疫强毒感染.
B5.3若监测鸡群的免疫水平,则血凝抑制滴度在4(log2 )的鸡群保护率为50%左右;在4(log2)以下的保护率达90%--100%;在4(log2)以下的 非免疫鸡群保护率约为9%,免疫过的鸡群约为43%.鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示,如平均水平在4(log2 )以上,表示该鸡群为免疫鸡群.