DNA探针鉴定转基因鸡早期性别

中囊毫-畲1999年第21毒第6．s．q China eo,at,y VoL 2t，No． 1999 ／ lf 马玉忠李赞东 中国农业大学生物学院北京 。。。 摘 要：质粒 pUGD1201经扩增 、提取、纯化、酶切等一系列过程而获得 了w 染色体特异 性 DNA片段 ，继而获得用地高辛标记的 w 染色体 DNA探针 用该探针通过原住杂文法对鸡 x期胚盘细胞成功地进行了性别鉴定。 』， qfr-．"／3 关键词：鸡；胚盘细胞；W染色体；DNA探针；性别鉴别；原位杂交平 7爸 ， 自转基因小鼠问世以来，转基因昆虫、鱼 、猪 、 兔 、牛和羊等相继制备成功 由于禽类的生物学特 点，转基因研究起步较晚，进展缓慢。目前人们多 采用 x期胚盘细胞生产转基因禽类 ，而胚盘细胞 转移法生产的嵌台体又是生产转基因禽类的有效 工具 之一。 在禽类 ，雄性的性染色体是 ZZ，雌性的性染色 体是 ZW，即在雌禽的体细胞核内含有大量的 w 染色体 DNA片段 。用地 高辛 标记的 W 染色体 DNA探针鉴定早期胚胎的性别 ，避免了胚盘细胞 转移法制备嵌合体时异性胚胎的转移 ，为高教地、 有 目的地培育体细胞或种系嵌合体提供 了可能 ， 也为供体细胞在嵌合体中的分布提供了重要 的手段 1 材料和方法 1．1 材料 质粒 pUGD1201由 日本东北大学寺西美佳教 授惠赠。限制性核酸内切酶 EcoRI购 自华美生物 公司。地 高辛检测和标记试剂盒 购 自德国 Boehlinger Mannheim公司 。DNA快速 回收纯化试 剂盒，购自博大科技公司。 京白鸡种蛋由北京家禽实验孵化场提供 ，京 白鸡由本课题组饲养。 1．2 方 法 1．2．1 质粒 PUGDl201的大 量 制备 质粒 pUGD1201在大肠杆菌JM107中扩增 ，聚乙二醇纯 收稿 日期 ：1999—133—03 化 ，定量后溶于 TE缓冲液中，．20℃保存。 1．2．2 酶切 质粒 pUGD1201 100 bLL，加 入 10×BufferH 20 bLL、EcoR I40 bLL、ddH2O 40 L， 37℃水浴 2 h。55V条件下琼脂糖凝胶电泳，0．5M EDTA(pH 8．0)终止反应。 1．2．3 染色体 DNA片段的回收 酶切产物 电泳，从琼脂糖凝胶上切下 1．2 kh的 DNA片段， 用玻璃奶法回收，获取浓度为 200 ng／bLL的 w染 色体片段 。 1．2．4 W染色体探针的标记 取上述 w 染色 体 DNA片段 1．0 lag，用无菌双蒸水将体积加到 16 L，在沸水中变性 10 min，迅速放在冰上4 min，然 后加人 4 L引物 37℃保温 2 h。加入 2|LL 0．2M EDTA(pH8．0)终止反应。．2O℃保存。 1．2．5 胚盘细胞 的分离 取新鲜京白鸡种蛋的 部分胚盘，10％的胰蛋白酶消化，获得的胚盘细胞 涂片以备原位杂交用。 取成年京白鸡公鸡 、母鸡各一只，抽取血液进 行涂片，分别作为阴性、阳性对照。 1．2．6 原位杂交 上述涂片经 4％多聚甲醛固 定，蛋白酶 K消化，预杂交及 1 ng／ L的 w染色 体 DNA探针杂交 ，NBT／BCIP系统显色等一系列 过程 ，光镜下观察结果。 2 结果与分析 2 1 质粒 pGUD1201的提 取和酶切结果 获得了 1．2 kb的 w 染色体 DNA片段，质粒 DNA、质粒酶切液 、1．2 kb的 w 染色体 DNA片段 一 10一 ＼ ‘ 维普资讯 http://www.cqvip.com ⑦ 中圈采令1999年 21卷 6期 Chi,~Pog!t~Vo1．21．No．d 1999 与核酸 Marker，提取的 DNA片段大小和纯度与预 期结果相符，质粒的提取和酶切成功。 2．2 W 染 色体 DNA探 针的标记 将所获得的 w 染色体 DNA片段用地高辛标 记后，稀释成不同浓度 ，分别点在地高辛定量试纸 的各方格内，与对照试纸条一起，经抗体结合 、显 色等步骤 ，可看到对照试纸条和点样的定量试纸 条上都有从高到低的蓝紫色斑点显示，表明 w染 色体 DNA片段已被地高辛标记上 2 3 原 位杂交结果 从所涂的 l6个胚盘细胞片上看，有 7个胚盘 的细胞核被染成蓝紫色，表明为雌性；其余的无蓝 紫色显示，表明为雄性。所取种蛋除 2个在孵化的 第 3天死亡 (性别无法鉴别)，其余正常孵出，即孵 出了6只母鸡 、8只公鸡，与检测结果相符 另外， 母 鸡 的红 细胞核 被染 成蓝 紫色 ，公鸡 的呈阴 性 3 讨 论 刚产出种蛋的胚盘细胞处于发育的 x期，是 一 种多潜能细胞。原始生殖细胞 (PGCs)起源于 x 期胚盘明区的中央盘．它是精子和卵子的前体 因 而操 作 x期 胚 盘 细 胞 可 看 作 是 操 作其 中的 PGCs。 运用嵌合体制备转基因动物及进行物种保护 的一个重要条件便是嵌台体为种系嵌台体。如何 提高嵌合体的比例，特别是种系嵌合体的比例是 嵌合体制备的关键。以往嵌合体的确定通过交配 实验 、羽毛的颜色及 DNA指纹 ，但供体和受体的 性别无法早期确定 ，性别的确定往往是在孵化 3 d 观察其原始生殖腺的组织学结构或孵化 8～9 d胚 胎卵巢的大小 ，无法预知受体胚胎生殖腺中外源 PGCs的可能比例。且供体细胞来自数个胚胎，因 而产生了大量的混合种系嵌台体。家禽w染色体 DNA重复序列的鉴别和克隆为在分子水平上早期 鉴定禽胚的性别提供了可能。 自然条件下 ，畜禽繁殖的后代基本上是雌雄 各半 。然而在商业生产中人们却希望得到较多的 雌性或雄性畜禽。若能在孵化前识别出胚胎的性 别 ，可大大提高经济效益；同时，也可有 目的地生 产不同性别的转基因禽类。用 w 染色体 DNA探针 鉴定早期胚胎 的性别，为高效地 、有 目的地培育体 细胞或种系嵌合体提供了可能，也为探测供体细 胞在嵌合体中的分布提供了重要的手段。为挽救 珍稀鸟类 ，也为发育生物学的研究提供了一条有 意义的途径。 主要参考文献： I Hanrburger V d al A series of normal stages in the development of the chick embryo，I Momhe 1．195l；88：49—92 2 Kagami H et a『Sexaal diffe~miafion of chimeric chickens COH- tainhhg Zz and ZW eelis ；nI germline MolDer．I995：42：379—387 3 Maed丑T e【a1．Dislfibufi~ of blastod~ al celIst~nderred to chick enrbryos for ch；mem Dr0ducd0n using windowed eggs BriPmdSei．1997；38：24l一244 4 Shaw DL e【a1．The{ le 0f fem e donor bh¨odennaI elIs l口reale chi~ ric eh~kens．Bi~hemCell Bio．1992；70：1218一 l229 5 Thoraval P et ．Somade and铲m llne chicken chime~ obtained from brown and white leghe~ by trat~fer of ea-1 bl~tedemlal celis poulSe1．1994；73：I897一I905 6 Ton M el ．Demonstralfon of W chromosome—speeitle~petltive DNA sequences in domestic fowl， Ga1]us g Domestieus Chromosoma， 1982；86：551—569 Early Stage Sex—determination of DNA Probe oR Transgenetic Chicken Ma Yuzhong Li Zandong (College of Biological Sciences，China Agricultural University，Beijing 100094) Abstract W Chromosome-specific DNA fragment WilLS oblained after transformation，extra．ion ，purifiCalion and digestion with EcoR I of pUGDI201． e W Chromosome-specific DNA Probe a 1．2 kb insert which labeled by the random-teehr~que using a Digexigenin Labeling Kit with this probe． Sex—determination of chicken singe X blastodermal cells were doae by in silu hy- bridization． Key words Chicken；hlastodermal cell；W Ch10m specific；DNA Probe；sex—delerminaliott；ln situ hyht4d／mtioa ■ 章 维普资讯 http://www.cqvip.com