哺乳动物的性别控制

· 综 述 · 哺乳动物的性别控制 gf t ． 善宝生 ．垒兰把 L一一／ 一 (解放军农牧大学畜牧水产系，长春 130000) (军事医学科学院实验动物中心，北京 10(1071) 张忠诚 陈永福 (中国农业大学动物科学技术学院，北京 100094) (中国农业大学生物学院．北京 100094) 摘要 较系统地阐述1哺乳动物性别控制在畜牧业生产及相关学科中的意义．全面 客观地介绍1 X、Y性别精子的分离方法和胚胎性别鉴定方法等内容的研究现状和 存在的问题。 美蝴旦塑 胆膨． 性别控制是指通过人为方法使成年雌 性哺乳动物按人们的意愿生产出特定性别 (雌性或雄性)后代的技术。性别控制的研 究方法划分为 3大类 ：①X、Y精子的分离； ②附植前胚胎性别鉴定 ；③妊娠早期胎儿 性别诊断。 性别决定的遗传机理就是雄性配子携 带的 Y一染色体短臂上的 SRY基因的达 决定胚胎性腺向睾丸分化。 1 性别控制在畜牧业生产及相关学科中的 意义 ①预测和控制家畜的遗传和表型性别． 可增加选育强度，获得最大的遗传进展。 ②充分发挥种母畜的繁殖潜力，提高母 畜的繁殖效率．进而提高畜牧业的经济效益。 @防止牛的异性孪生不育症。 - ④性别控制与胚胎移植、胚胎冷冻等技 术的应用．可加速濒危动物、珍稀动物 (如红 鹿)的繁殖和保种进程(Ja~ar，1996)。 ⑤提高优良畜群的增殖速度．促进国际 间胚胎和冻精的交流。 ⑥性别控制也是体外受精、核移植单精 收稿日期 1997—08—20 改回日期 1997—09—16 ·14 · 注射及转基因动物的一项配套技术．它的应 用必将促进其它生物技术的发展。 2 性别控制的研究现状及评价 当前，控制性别的方法主要有 3大类， 其中最理想的途径是通过分离 x、Y精子来 改变动物的性比率。较理想的方法是通过鉴 定附植前胚胎的性别来有选择性地生产特 定性别的后代。 2．1 X、Y精子的分离方法：通常 x、Y两类 精子之间在物理和化学方面存在有差异．如 精子的大小、形状、重量、密度、活力(含运动 类型和速度)、表面电荷、DNA．含量以及酶 活性等。这些差异就为 x、Y精子的分离提 供了理论依据。然而，无论何种分离方法都 必须符合 3个标准，才能让人接受，乃至应 用于生产。首先．所用方法必须使分离后的 x、Y精子的比例有显著地改变．同时，不影 响体内和体外受精．并能获得同预先决定 x、Y精子比例相符的后裔 (胚胎或活的后 代)。流式细胞仅做种群分析时，也许可以满 足第一条标准 (Johnson．1994)：其次，分离 后的精子可以用于人工授精：第三，分离后 的精子也可以用于体外受精、胚胎移植，并 能产生后代。 船 ¨ 嘲 学 蝌 ～ 内 维普资讯 http://www.cqvip.com 葛宝生 等：哺乳 钎特 曲性别控制 2．1．1 精子的核型分析：用 Quinaerine对精 子染色后，根据 Y一染色体是否产生荧光来区 别 x一、Y一精子，因为这种染料能使精子的Y 染色体长臂发出荧光。如用 Quinaerine进行 精子涂片染色．有39％～47％Y染色体显示 出荧光点(F一小体)。 2．1．2 免疫学方法：自Eiehwald和 Silmser (1955)发现 H—Y抗原之后。用免疫学方法 研究性别控制取得了较大进展。Bennett和 Boyee最先报道了用血清学方法检测到小鼠 精子表面存在 H—Y抗原。并用 H—Y抗血 清的细胞毒方法对 x一精子进行富集，但后 代性别比例改变不明显。Bryant(1980)首次 用 H—Y抗血清免疫亲和柱层析方法对小 鼠的精液进行分离．H—Y阳性的小鼠精液 授精后得到了 90％的雄性后代。Bradely (1989)用同样的方法对绵羊精子进行了分 离，其 H—Y阳性分离率为 80％．H—Y阴 性分离率为 70％～80％。Ali(1986)用 H— Y单克隆抗体分离 x、Y精子。并用荧光激 活细胞分选仪 (FACS)来验证其分离结果， 即富集后的 Y精子 80％是 H—Y阳性，富 集后的 x精子 70％是 H—Y阴性。人们还 认为合适的 H—Y抗体可以用于大规模人 工授精的x、Y精子的分离。然而，现有的证 据似乎表明。至少在小鼠，其 x、Y精子对 H—Y抗血清都表现为阳性。与这一结论一 致．由流式细胞仪验证的 H—Y抗原法分离 的精子在性别比例上没有改变 (Johnson， 1994；Palmer，1989)。 2．1．3 沉降法分离 x、Y精子：用于精子分 离的大多数技术都是根据非平衡沉降法或 密度梯度的平衡沉降法原理进行的。 Kaneko(1984)用 Pereoll密度梯度离心 富集x精子．其富集率为 94％。尽管这一结 果非常理想，但是后来没有人能重复这些数 据。相反，另外两种分离动物 x、Y精子的实验 方法似乎是能站得住脚，可重复、可应用于生 产的。一种是血清白蛋白分离法(富集法)，可 获得 75％-80％的 Y精子；另一种是用葡聚 糖凝胶过滤。得到了 70％～75％的x精子。 Moore等(1975)用等电聚焦技术分离了精子。 2．1．4 流式细胞仪分离 x、Y精子：在一些 家养动物，它们的x精子较 Y精子大(一般 约大2．9％～4．2％)，并且 x染色体带有 更多的 DNA。X一、Y一精子的 DNA含量 差异是从人的 2．8％(Johnson，1992)到田 鼠的 12．1％(Johnson，1989)。用流式细胞 仪测量细胞 DNA 的微小差异是 60年代后 期发展起来的一项技术。首次将流式细胞仪 用于分离 x、Y精子就是 Johnson及其同事， 尽管分离后的精于活率有所下降 (Johnson． 1987)。最近几年，Johnson等已改进了一台 流式细胞仪，并且用它生产出了富集x精子 和富集 Y精子。用流式细胞仪分离的精子借 助于体外受精和珏胎移植技术 已产出了预 知性别的犊牛。通过外科手术输入分离过的 精子也已生产出了猪、兔和绵羊，因为这种 方法的精子用量要较人工授精的精子需要 量少很多。用这项技术生产的所有后代的形 态都很正常，猪和兔的后代经两代繁殖表现 出了正常的繁殖性能 (Johnson，1994)。然 而，当前用流式细胞仪分离精子这项技术的 主要缺陷是分离精子的效率太低，每小时只 能分离 3 5×10 个精子．这就很难在人工授 精技术的常规使用中被接受。换句话说，此 项技术 目前还不能真正地应用于畜牧生产。 2．2 胚胎性别鉴定方法 2．2．1 免疫学方法：免疫学方法检测胚胎性 别主要是利用 H—Y抗体(抗血清)或 H—Y 单克隆抗体检测附植前胚胎是否存在有 H—Y抗原。 ①间接免疫荧光法1是将胚胎在含有 H—Y抗血清或单克隆抗体的培养液中培 养．然后再加入荧光素标记的第二抗体，在 荧光显微镜下观察是否呈现特异荧光。美国 学者 White等自1983年起用间接免疫荧光 法成功地鉴定了小鼠胚胎的性别．接着他又 ·15· 维普资讯 http://www.cqvip.com 内 荤古 畜牧科学(1998年 第 2期 ) ·综 述 · 于 1984和 1987年成功地鉴定了猪、牛和绵 羊胚胎的性别。White等(1987)用染色体分 析法对问接免疫荧光法鉴别的牛、猪和绵羊 胚胎的结果进行了验证，在牛胚胎中雄性符 合率为 85％，雌性为 97％；绵羊胚胎雄性 符合率为 84％．雌性为 85％：猪胚胎雄性 符合率为 77％，雌性为 86％(White．1987： Wachte1．1988)。 1989年，Booman用自己制备的 H—Y单 克隆抗体．并用间接免疫荧光法鉴定了牛胚胎 的性别．经染色体分析 73％～77％的胚胎性 别符合荧光鉴定结果。Wood(1988)用Booman 提供的单克隆抗体鉴定了马囊胚的性别，染色 体分析表明 82％的胚胎符合荧光鉴定结果。 Zhu Yuding等 (1996)用制备的H—Y单克隆 抗体通过间接免疫荧光法鉴定了小鼠胚胎的 性别．经PCR验证表明荧光胚胎 67．31％为 雄性．82．22％的无荧光胚胎为雌性。 目前免疫学法鉴定胚胎性别的准确率 一 般为 85％左右。其原因：一是H—Y抗原 是一个弱抗原，H—Y抗血清的特异性较差； 二是用 H—Y单克隆抗体取代 H—Y抗血 清，并用问接免疫荧光法鉴定胚胎性别时， 判断荧光胚或无荧光胚参与了较多的人为 主观因素，从而致使鉴定准确率不很高。 @囊胚形成抑制法：是利用 H—Y抗体 和胚胎发育的差异来可逆地抑制雄性桑椹 向囊胚的发育．从而达到性别鉴定的目 的。当将受精卵置入含 H—Y抗血清的培养 基中培养时，H—Y抗血清可逆地抑制雄性 桑椹胚形成囊胚，当把这些受抑制胚胎移入 t 无 H—Y抗血清培养基中．它可以继续发育 并形成囊胚，如移植还可发育成雄性个体 (Utsumi，1991)。这些结果表明 H—Y抗体 能特异地抑制雄性胚胎的发育。 ③细胞毒法：细胞毒法鉴定胚胎性别是 用含有 H—Y抗血清及补体的培养液培养 胚胎．表达 H—Y抗原的雄性胚胎有一定程 度的细胞裂解或发育受阻，不能形成正常的 ·16· 囊胚．此类胚胎判为雄性；相反．能正常发育 的胚胎被判为雌性。Krao等(1976)用细胞毒 法鉴定了小鼠胚胎性别．移植雌性胚胎后得 到了 58只幼鼠，其雌性胚胎性别鉴定准确 率为 86％(∞／58)。因这种方法对雄性胚胎 有损伤性，故目前已很少使用。 2．2．2 X一染色体连锁酶定量法：哺乳动物 雌性个体有两条 x一染色体，其中一条在发 育早期失活；另一方面，雄性只有一条 x一 染色体。因此，x一染色体编码的酶的活性雌 性是雄性的两倍。并且测量酶活性应该在 x一染色体失活开始之前进行 。Williams (1986)用比色分析测定了整胚的葡萄糖 6 磷酸脱氢酶(G PD)的活性，而且能够显示出 胚胎酶活性的双峰分布。移植胚胎后证实双 峰分布与雄性胚胎和雌性胚胎是相符的。总 的来说，使用此法鉴定胚胎性别的准确率为 64％。另外，Monk和 Handyside还测定了 x一染色体连锁酶——次黄嘌呤磷酸棱糖转 移酶 (HPRT)的活性，而且还揭示了 HPRT 的活性与常染色体编码腺瞟呤磷酸核糖转 移酶 (APRT)活性的比率关系。从 8一细胞 胚胎 分离单 个 卵裂 球测 定 其 HPRT 和 APRT的活性．获得了如上所述的双峰分布 图。所获得的 15个胎儿中有 l4个(93％)的 性别与预测结果相符。然而，鉴于 x一染色 体失活机理和失活时间还不很清楚，加之酶 活性差异甚微，故本法难以应用。 2．2．3 细胞遗传学方法 (棱型分析)：细胞 遗传学方法是经典的胚胎性别鉴定法。早在 1968年，Gardner和Edwards就用细胞遗传 学方法鉴定了 5日龄胚胎的性别。虽然各种哺 乳动物的染色体数目不同．但其胚胎的棱型 (XX或XY)是一致的。在胚胎发育的早期．雌 性胚胎中的一条x一染色体处于暂时失活状 态，在雌性胚胎细胞的核膜附近会出现一个 着色较深的异染色质小块，称为Barr氏小体。 在大家畜．Barr氏小体与细胞所处的分裂周 期、固定方法有较大关系 因而观察 Barr氏 维普资讯 http://www.cqvip.com 葛宝生等：哺乳动物的性别控1l{ 小体的难度较大。随后，人们把研究焦点转 向对染色体形态和数目的分析。这就需要对 胚胎进行活组织取样 (获取部分细胞)。直接 分析染色体或阻断培养至细胞分裂中期，再 进行染色体分析，按照性别鉴定的染色体标 准对胚胎性别作出判断。这种方法虽然准确率 达 100％，但属损伤法；同时，得到中期分裂 相的难度很大。也相当费时，不适用于生产 实际，但可用来验证其它性别鉴定技术。如 以该方法鉴定小鼠胚胎性别的结果为标准， 得出间接免疫荧光法和 PCR扩增部分 SRY 序列法鉴定小鼠胚胎性别的准确率分别为 74 0％(74／100)和 92．86％(26／28)。 2．2．4 分子生物学方法 ： 虽然雄性特异性 DNA探针鉴定家畜胚胎性别是 80年代后期 发展起来的一项技术，但其发展速度和诱惑 力远超过其它方法。I eonard等 (1987)首次 用 Y一染色体特异性 DNA多重复序列擦针 鉴定牛囊胚获得成功，他是从胚胎取 10～20 个细胞做原位杂交。其胚胎性别鉴定准确率 为 95％(81／85)。Herr等(1990)首次采用 PCR技术扩增 Y一染色体特异性多重复序 列鉴定了牛、绵羊等家畜胚胎的性别．准确 率达 91．6％和 96．5％。Sinclair(1990)和 Gubbay(1990)分别发现了人和小鼠的性别 决定基因 一SRY。Koopman(1991)用转基因 小鼠性反转实验对 SRY基因的功能加以验 证。用 PCR技术检’冽 SRY基因的有无即可 判定胚胎的性别。1992年。曾溢涛和胡明信 等参照人和小鼠的 SRY基因序列设计了一 对引物．对 17枚胚胎样本 (其中4枚整胚． u枚切割胚，2枚三分胚)进行 PCR体外扩增 作对照验证，其性别鉴定结果准确率达 100％。 一 葛宝生和许罕华 (1994，1995)按照人和小鼠 的 SRY基因序列设计合成了一对引物，用 PCR技术扩增出了牛、猪及绵羊 SRY基因 核心序列的大部分片断，并进行了序列分析 和同源性比较，结果表明这些动物的 SRY 核心序列具有很高的同源性。然而，尽管 PCR扩增 SRY法的操作过程极易污染，且 对胚胎有一定损伤，但是考虑到其准确度很 高，只需取 2--3个卵裂球细胞，且 3 h内可 完成等优点，现仍不失为胚胎性别鉴定的一 种理想方法。 2．2．5 其它方法 ：胚胎克隆或称核移植是 将分离的卵裂球或成体细胞 (核供体)与成 熟并去棱的卵母细胞(棱受体)融合，不经有 性繁殖过程连续地复制遗传相同的胚胎，并 经胚胎移植获得大量性别一致的复制后代。 因此。用胚胎克隆方法来实现性别控制，具 有诱人的前景，但目前该项技术还不成熟。 还有人通过胚胎分裂率的差异来实现胚胎 性别鉴定，但未获得令人满意的结果。 2．3 妊娠早期胎儿性别的诊断 ：妊娠早期胎 儿性别的诊断可用核型分析、H—Y抗原、 DNA探针鉴定经羊膜穿刺得到的细胞。另 外一种方法是直肠超声波诊断法鉴定胎儿 性别。这种方法常在农场条件下精确鉴定牛 (Curran、1992)和马(Currall等，1989)胎儿 的性别。该法是通过鉴别和确定生殖结节与 周围结肠的相对位置来鉴定胎儿的性别的。 生殖结节这一胚胎结构在雄性将分化为阴 茎，在雌性分化为阴蒂。Curran的实验表明， 诊断牛和马两种动物胎儿性别的最佳时间 是排卵后 59～68天。性别诊断的准确率接 近或达到 100％(Curran。1992)。 综上所述。随着细胞遗传学、分子遗传 学、免疫学及分子生物学等学科的不断发 展。深信在不远的将来，人们必将会彻底探 明哺乳动物性别决定基因的表达和调控机 理：或从免疫学角度寻找出一种雄性特异性 强抗原．如雄性特异性增强抗原或许具有这 种可能性：或在 X、Y精子的分离方法上获 得重大突破，使其分离效率大为提高以致于 能够满足人工授精的常规操作需要，同时使 其分离准确率达到 95％以上。从而按人们的 意愿完全控制哺乳动物后代的性别。 (下转 第 31万) ·17 · 维普资讯 http://www.cqvip.com {擞忠等：黄革的栽培技 要点试驻 ★代表可利用长度 耕翻使土壤更加疏松，因而对黄芩的根部 生长有利，侧根和须根的数量相对较少．主 根长度较大，所以药材的品质比直播法好． 由表 2可以看出。 2．2 夏末育苗较之春季育苗更为合理，具有 育苗数量多 (出苗率和成活率高)，减少劳动 力(防锄杂草)，提高土地利用率等优点。7月 中下旬播种，此时地温较高，又值雨季，使得 出苗时问提早，出苗率提高i并且生长发育速 度较快，与春季育苗相比，最为重要的是避开 了 5～6月期间恶性杂草对幼苗的严重侵害 试验过程中的用工记录显示，苗期的田间管 理(主要指人工锄草)可比春季育苗的劳动用 工减少 2／3以上，也大幅度节省苗期灌溉用 水，而且夏末播种育成的苗在来年春季移栽 后。当年秋季也能成长为合格药材。另外，7月 中下旬育苗用地还可于当年春季种植一茬作 物(小麦、蔬菜均可)。笔者认为夏末直播也是 生产上较为可取的方法，也可于当年多种一 表 3 夏教育苗根部生长发育豆越冬临界期试验 播种(日／月)越冬率(％) 根粗(丌1m)／根长(cm) 茬作物，而且具有不需移栽、节省劳动的优 点．但需间苗定植，浪费种子。 2．3 越冬临界期分析。表 3所示，育苗播种 期从 7月中旬至 8月下旬的植物均可安全越 冬。但从第二年生长状况来看，笔者认为播期 7月中下旬为最佳．最迟不要超过 8月上 旬，因为尽可能提早播期可使其根部发育时 间与营养积累相对充分，从而影响到来年栽 植后的生长速度和根部发育．有利于提高药 材产量和品质。 (上接 第 17页) 参考文献 1 Curran S．Theriogeno[ogy．1992．37：17～21 2 Johnson L A Iso]atlon of X—and Y—bearing spermatozoa preselection．In Charlton H M (ed Oxf0rd Rev of Reprod BioI_l994．16：303～326 3 Johnson L A anddark R N ．Gamete Res．1988． 212：335～343 4 Johnson L A anddark R N Mol Reprod Dev。 l989．27：159 5 Johnson I A et ．TbeT；0gen0102y 1994．41： 51～ 56 6 Koopman P et ．N8ture ．1991。351．117～ 121 7 M onk M and Handyside A H ．Reprod Fe ， 1988．82 365～368 8 Page D C et al Cel1．1987，51：1091～ 1104 9 Pa[mer M S ec a】．Nature．1989．342：937～939 10 Simpson E e【aI Nature 1987．32：876～ 878 11 Sinc[air A H et a1．Nature。1990，346：240～244 12 Utsuml K et a1．J Exp Zoo[，1991．260：99～105 13 Van Vliet R A et a1．Ther 0genoIogy，1989，32： 421～ 438 14 W achte1 S S et a1．Ferti1 SterlI。1988，50：355～ 360 15 W hite K L et ．Gamete Res．1987 17： 107～ 1l3 作者简介 ：葛宝生，内蒙古农牧学院 83届 畜牧 专业毕业．现 在中国农业大学劫抽科披 学院建 读动 抽繁殖专业博士学位 。 ·31· 维普资讯 http://www.cqvip.com