动物的性别控制

动物科学与动物医学 2 004年 1月第 21誊第 1期(总第 1 0 3期 ) 动 将 的 性 别 控 簧 文国艺 何著钢 石德顺 李兴芳 王士长 (广西大学动物科技学院，广西 南宁 53o0lo5) 中!tt分类号：S8l3．15 文献标识码：A 文章箱号：1008—9381(2004)0l一0O1 5—03 摘 要：摘要：动物的性别控制是指通过对精子或胚胎的性别鉴定以达到调控子代性别的目的，人为调控动物的性 是‘ 类长期双呆的慝 望 ，随着胚胎冷冻、胚胎切割、体细胞克隆技术的 日渐成熟，动物的性别控制显得更为重要： 关键词：性别控制；性别决定；性别鉴定 Ⅸ Conm~1 0f~．ivm,AIm Wen Guo——yi He Ruo——gang Shi De——shun Li Xing——fang Wang Shi——chang (Animal reproduction institute of Guangxi University Guangxi Nanning 530005) ~ ：Sex control of animals means to adjust the offspring S sexuality via identification of sperm or embDos， sex control is a long purpose of human being which is much more important day after day with the development of emb~o cryopreservation、embryo splitting and somatic cell nuclear transfer． K坷 words：sex control；sex determination；sex identification 即便是单细胞细菌就开始有了“性别”的分化 ，“雄”细菌 可以通过性霰毛将遗传物质质粒转移到“雌”细菌中一性别， 是具有一定遗传基础的遗传性状，同时又是发育的结果，也 受到环境的影响。如果遗传基础和环境发生变化，性别会随 之变化 ，某种程度上 ，动物性别 的形成 、发展 、变化还存 在许 多未解之谜。 通过人工手段干预雌性动物获取人们所需性 别后代 的 性别控制技术，是动物科学和动物医学新的机遇和挑战 一 个世纪 以来 ，性别形成机理 已由形态学水平发展到分子水 平 ，近 10年来 ，随着分子生物学、细胞遗传学 、免疫组织学的 迅速发展，以及现代高精密仪器的问世，性别控制研究取得 了长足进展 ，特别是胚胎性 别鉴定 已进入实用 阶段 ，人 为控 制动物性别的时代为期不远。随着胚胎冷冻、胚胎切割、体细 胞克隆技术的 日趋成熟 ，动物的性别控制显得更为重要 一哺 乳动物特别是家畜的性别控制主要是受精前的性 别鉴定和 胚胎性别鉴定，前者主要指分离 x、Y精于，在受精时就决定 了性别；后者是通过鉴定胚胎的性别以影响出生性比1． 别 鉴定是性别控制的应用生长点 ，对育种 、生产和疾病防{fi,有 十分重要的意义。 1 性别决定原理 哺乳动物性别决定依赖于 Y染色体上的 SR't基因，它使 原始性腺发育为睾丸。另外，通过对性反转病例的研究发现。 在 x染色体和常染色体上还存在一些与性别决定相关的基 因，因此，性别决定是一 个多基 因级联调控的过程 ，比一般的 分化 、发育更复杂 。一百年前 Mc Clung在研究蝗虫精细胞 时，首先提出了性别决定理论。上世纪中叶 ，细胞遗传学的发 展使动物性别决定取得划时代的突破，证明了鼠和人的雄性 性别 由 Y染色体决定；此后陆续发现 ，性别决定为两级决定， 包括初级性别决定(由染色体决定性腺发育)和次级性别决定 (性腺分泌的性激素决定身体表型)，人类有一些多 x和单Y 收稿 日期：2003—11—18 的综 合症个体 ，发育为雄性 ，说明 Y染色体在性别决定 中是 关键因子；人们发现 Y染色体是性别决定因子以后，一直在 寻找性别决定基因，认为有决定睾丸分化的基因 l99o年，英 国的 Sinclair和 Gubbayf发现包括人类在内的哺乳动物 Y染 色体短臂上靠近常染色体区的35 kh区域存在性别决定因子 (SRY) 随后通过对 SRY基因的序列 和编码产物 、表达 时空性观察及一些性反转病例的研究 ，确认 SRY／So"是决定 睾丸分化的候选基因 1991年 Koopman等进行 了，小鼠性反 转试验，将含有 SRY基因的 14 kbY染色体片段显微注射到 雌性小鼠胚胎中，结果雌鼠发育成雄性．其大小、体重、交配行 为与正常雄 鼠无异，从而证明了 SRY为哺乳动物的性 别决定 基因： SRY基因为开放的读码框架结构 叮编码 204个氨基酸 肽键 ，其中之一是能编码 80多个保守氨基酸框架的睾丸决定 因子基因(TDF) 由于 Y染色体的存在 SRY使性腺原基发育 为睾丸 ，睾丸形成后 ，其间质细胞分泌睾酮产生雄性结构 ，支 持细胞分泌抗缪勒氏管因子，抑制缪勒氏管发育=如果 Y染 色体缺失，性腺原基发育为卵巢，由卵巢产生的雌激素能使缪 勒氏管发育为雌性结构 后来发现 有 Y染色体存在，但若 TDF变异缺失 ，动物也发育为雌性： Lovell～badge研究人类的 SRY基因发现 、它仅含有一个 850 bp的外显 子，其中有一段可编码 7l，＼氨基酸的保守 区序列编码的 SRY蛋白的 DNA结合结构域 ．该基因起 始密码子上游 91 bp处有一个重要的转录起始位点 小鼠的 Sry也是单外显子，它与人 HMG—box的同源性高达 71％一Gao 的实验研究表明在囊胚腔形成时期．雄性动物的胚胎已经有 Srv的转录出现 而囊胚腔晚期转 录水平较高 说明植入胚眙 前已经有雌雄异型的 S 基因表达形式 SRY基因HMG编码的蛋白质是一种 DNA结合蛋白。在 双螺 旋结 构 中引 入～ 个尖 锐 的转折 ，SRY蛋 白质通 过 与 DNA双螺旋小沟的核苷酸相互作用识别核心序列 AACAATG， Sry识别 CATI'GTY。关于 SRY蛋白质调控机理 ，有人认为是 电子 邮件 ．animalscience@china．com huihuiily@hotmail．com 维普资讯 http://www.cqvip.com Anima1 Science ＆ Veterinary Medicine Vo1 ． 21 No．1(Total No．103) SRY／Sry的 HMG功能区与 DNA结合 ，引起 DNA变形 ，并使 SRY／Sry蛋白与受控基因的启动子序列结合，将远距离的调 节位点拉近，从而调节基因表达。Dubin通过构建嵌合基因发 现 ，Sry有一种抑制功能。 人类 XY／SRY阳性雌性 、XX／SRY阴性雄性的出现，说明除 Y染色体外还有其它染色体存在其它的性别决定基因。Wtl基 因有抑制细胞分裂和分化的功能，与间质细胞形成精巢有 关；MIS／mis是由胚胎的支持细胞分泌，诱导缪勒氏管的退 化；SF—l因子直接调控 MIS的表达，诱导其转录，它对于睾 丸和肾上腺发育是必需的；DAX一1／dax—l基因编码一种核 激素受体，对SRY基因有抑制功能，也有人认为 dax—l是卵 巢决定基因；SOX3是SRY相关基因，从进化的角度看，两者 非常接近 ，可能起源 于同一共同的祖先基因 ，另种观点认 为 它们可能是一对等位基因 ，在两种性别胚胎 中编码 Sry结合 蛋白，在胚胎的中枢神经发育和未分化的性腺起作用。SOX9 也是 SRY相关基因；PIS是山羊的无角／间性基因，位于 1号 染色体，间性是受一个隐性基因控制，与常染色体的显性无 角基因密切相关，1997年首次从哺乳动物的常染色体检测 到性别决定基因。 胚胎早期 ，多种基因及产物如孤核受体 Wtl蛋 白、SOX9 蛋 白等诱导分化产生性腺 、肾上腺 等 ，雄性动物发育以 SRY 为核心，SRY启动 SF—l基因转录 ，进而 SF—l激活 MIS的表 达，MIS表达引起缪勒氏退化，吴夫氏管在精巢分泌的睾酮作 用下分化出雄性生殖器官，出现雄性表型。雌性动物因为没有 SRY基因，性腺发育为卵巢，同时SF—l的含量下降，MIS不表 达，吴夫氏管因无睾酮作用退化，缪勒氏管继续发育分化产生 雌性表型。 2 性别决定的分子模型 为了解 SRY基因的调控作用，合理解释各种性翻转现 象，近年来，人们就其分子机理提出了各种性别决定的分子模 型。1993年 McEcreavas提出了Z基因模型 ，1994年 Bardonil 提出了DSS模型，但都不能全面解释性反转现象。1996年 Jimenez提出关于 MPGs与 FPGs的新模型 ，考虑到正常的雄 性和雌性发育时间问，较深入揭示了性别决定的分子机制。 1998年 Jennifer与 Dmana Swain各 自提 出 另外 的新 模型 。 Jennifer认为 SRY基 因是通过 SOX3和 SOX9来参与性腺分 化的，设想在雌性中SOX3抑制SOX9的功能，从而抑制了 SOX9对睾丸决定的启动作用 ；在雄性中SRY基因抑制了 SOX3，使 SOX9启动了睾丸决定作用。Dmana Swain的模型提 出 DAXl与SF—l形成SF—l—DAXl二聚体，DAXl通过改变 SF—l的性质，来调整SF—l的激活功能。在卵巢发育中的SF一 1-DAX1二聚体抑制 SOX9等次级睾丸决定基因： 3 性别控制的方法 通常认为，动物性别在受精时确定，并且由雄性配子决 定，既性别发生是雄性决定问题；另外，由于性别是个发育性 状 ，故性别控制方法可从 3个方面进行。第一是控制雄性动物 仅产生一种类型的精子或分离 X、Y精子，然后使用特定类型 精子受精；第二是对出生后的性别进行控制，像小鼠的性反 转；第三是控制胚胎的性别，而怀孕初期可能是最有利的时 机，对晚期胚胎操作较困难，而且对已发生性别分化的胚胎进 行操作可能会造成致命伤害。 家畜性别为受精时决定，因此研究分离动物 X、Y精子， 是解决家畜性别控制的关键。人们根据X、Y精子在物理特性 (体积、密度、电荷、运动性)和化学特性(DNA含量、表面抗 原)不 同，采用流式细胞分离法 、沉降法、密度梯度离心法 、凝 胶法、电泳法 、免疫学方法等各种技术分离精子，但大多缺乏 可靠性 、重复性和准确性。一般认为，以X和Y精子所含 DNA量不同为依据的流式细胞分离技术较可靠。流式细胞分 离技术包括精液稀释与荧光染料 Hoeschst33342共同培养 ． Hoeschst33342染料可渗入精子膜从而使DNA着色。由于着 色量与DNA量成正比，因此 X精子发出的荧光比Y精子强： 放射出的荧光信号通过仪器和计算机系统扩增 ，分析并分离 出 X、Y精子。随着仪器的改进，分离的速度及精确度逐年提 高，至 2002年，分离精子的效率为 X和Y精子各 3 000个／s， 准确率超过 90％。精子分离后的受精效果以及产生后代性别 的准确性均较理想 。目前，流式细胞法分离精子尚有 以下问题 亟待解决：分离精子的受精力比正常精子偏低 ；分离精子经冷 冻后的复苏率比正常精子偏低；分离冻精和分离冻精后再冷 冻的问题 。 4 胚胎的性别鉴定 胚胎性别鉴定主要是鉴定胚胎的性别 ，以影响到出生性 比。早期胚胎性别鉴定方法 主要有细胞学方法 、免疫学方 法 、分子生物学方法，各有利弊 ，鉴别准确率也因人 而异。细 胞学方法是经典的鉴定方法。胚胎的核型为 XX或 XY．各种 家畜的染色体数目虽然不同，但早期胚胎一条 X染色体处 于暂时失活状 态，因此 ，从胚胎取 出部分细胞进行染色体分 析或阻断培养在细胞分裂中期进行染色体分析，即可鉴定 性别 ，该法优点是准确率可达 l00％，但采集细胞对胚胎有 伤害，且获得高质量的中期染色体分裂相也较困难 ，不适用 于实际生产，目前主要用以验证其他性别鉴定方法的准确 率。免疫学方法利用 H—Y抗血清或 H—Y单克隆抗体检测胚 胎上是否存在雄性特异性 H—Y抗原 ，从而鉴定出胚胎性别 ； 细胞毒性分析法是将胚胎和 X—Y抗血清及补体混合培养 ， 在培养过程中继续发育的胚胎分类为雌性，将出现个别卵 裂球溶解以及不能发育的胚胎分类为雄性，由于该法是以 破坏雄性胚胎为代价，故很少采用。间接免疫荧光分析法是 将胚胎在 H—Y抗血清或单克隆抗体中培养，再用异硫氰酸 荧光素标记的第二抗体处理，在荧光显微镜下观察，有荧光 的为雄性胚胎，无荧光的为雌性胚胎，该法优点是不损害胚 胎且具有较高的鉴别准确率 ，牛 的雌性胚胎达 89％，雄性胚 胎为 85％；绵羊雌性胚胎为 85％，雄性为 84％；猪的雌性 胚 胎为 86％，雄性胚胎为 77％。据报道 ．免疫学方法鉴别家畜 胚胎性别准确率约为 85％。由于 X—Y抗原是个弱抗原 ，H—Y 抗血清的特异性较差 ，H—Y单克隆抗体代替 H—Y抗血清也 未能提高鉴别准确率 ，而且对荧光强度 的估价人为因素很 大，故实际应用中还有一定的局限性。囊胚形成抑制法是利 t 量 ：010-62815657 62896235 62819395 传 l ：010—62819546 维普资讯 http://www.cqvip.com 动物科学与动物医学 2 004年1月第21卷第1期(总第1 O3期) 用H—Y抗体对雄性桑椹胚向囊胚发育具有可逆性抑制的原 理而发展起来的一种胚胎鉴定法。内海恭 三将大鼠 H—Y抗 体 与大 鼠桑椹胚共 同培养 6 min，形成囊胚 者判为雄性胚 胎 。雄性胚胎除去 H—Y抗体后再培养数小时 ，还可形成囊胚 将此法鉴别的两种胚胎移植后分别获得了79．1％的雌鼠和 91．3％的雄 鼠。Utsumi等用这种方法鉴别胚胎性别，获得 的 雄性胚胎准确率达90％以上，雌性胚胎准确率 80％以 分 子生物学方法是利用雄性特异性基因探针和 PCR扩增技术 鉴别胚胎性别的崭新方法 ，由于该法灵敏度高 ，准确率达 90％以上，其实质就是检测 Y染色体上的SRY基因的有无． 有为雄 ，无为雌 。DNA探 针法 ：从胚胎取下少量细胞 ，将其 DNA与 Y色体特异标记的 DNA序列(探针)杂交 ，阳性为雄 ， 阴性为雌 ；探针标记物有放射性同位素和生物素两种 ，前者需 要大量胚胎细胞和较长时间，同位素低温曝光需 7—8 d；后者 设备简单，技术难度较大，耗时短约为一天，但可鉴定的胚 胎较少 。PCR扩增法 ：应用 PCR技术对家畜胚胎进行性别鉴 定就是建立家畜 Y染色体 DNA文库及筛选得到特异的克 隆并进行测序的基础上 ，并合成一对与 Y染色体特异 性片段两端的正链 和副链 的小片段单链核苷酸引物 ，长度 在 20 bp左右 ，并在胚胎分割技术 的支持下 ，用少部分分割 胚细胞中的 DNA为模板进行 PCR扩增 。将扩增产物进行琼 脂糖凝胶 电泳并用 EB染色后 ，再进行 紫外激发检测 ，出现 特异带 的是雄性胚胎 ，否则为雌性胚胎 ，该方 法具有快速 、 敏感 、简便的优点 ，目前 已被 国内外研究人员广泛用于家畜 胚胎 的性别控制 ，但 容易污染 ，故在操作过程中要 严格 操作程序。 吴伟等采用 A、B、C三种方法限制Y精子活力，探讨对 犊牛性别的影响 。A方法向 230头母牛子 宫颈内注入 5％L 型精氨酸，B方法对 160头母牛分为排卵前半 8～10 h输精 和接近排卵时输精，C方法将前两者 2种方法合并处理 ，三 种方法产母牛率分别63．8％、65．7％和66．7％，与48．8％的对 照组相比，差异均极显著。有人研究发现，在母牛排卵前授精 易得雌性后代 ，在接近排卵时易得雄性后代，在受精当时预测 的犊牛性别与实际产犊牛性别的符合率达到约 70％，陈元明 等在对猪的实验中发现，排卵前受精得母仔 55．6％(69／124)， 排卵后受精得公仔 57．3％(75／124)，在生产实践中有一定的 应用价值 。刘润铮等采用 Pereoll梯度离心法和电泳法分离 奶牛的精子 ，并用分离后的冷冻精液给 460头母牛输精 ．试 验牛的产母率，Percoll为 63．5％，电泳法为63．7％，与对照组 48．8％相比均差异显著。两种方法对性别控制影响差异不显 著。齐义信等采用紫外扫描显微分光光度计检测牛精子的 DNA，结果 B型精子比A型精子 DNA含量少 4．4％，利用 A 型或 B型精子受精其后代分别趋向雄性或雌性，通过对公母 畜同加影响，加大性欲对比差利用四因子生母和三因子生公 技术是提高产母率 、产公率的有效途径 ；重复试验结果显示， 生母率为 76．6％、生公率为 74．2％，对照组母犊率为46．5％ 荆福林使用性别控制液，试验组获母牛犊 62．5％、对照组为 30．0％，差异显著。赵宗胜等的研究表明，精氨酸作为鲜精稀 释液，可明显提高绵羊产母 羔率 7～12个百分点 ，并且 0．5％ 剂量组好于 1％剂量组 。王志清等采用 Y精子抑制剂从公兔 45日龄起拌入饲料中喂养 ，至性成熟后 ，通过 自然交配方式 获得 156只仔兔 ，其雌雄 比为 2．9：1，明显高于 1：1的 自然性 比 。 5 现状及展望 近年来 ，人们进行了大量性别控制方法的实用性研究 ，其 中许多开始实用性应用 例如用不同浓度的精氨酸输入授精 前牛子宫，以调节受精条件，产生了很好的效果，家禽利用伴 性遗传原理，培育成功了雌鸡性别自别品系，通过控制或改变 胚胎及个体发育条件来控制性别，Resade在猪饲料中添加镉 元素或锌元素使后代雌性个体增多：1999年，在工程院旭日 干院士的领导下，我国研究人员将 国外生产的 良种肉牛试管 冷冻胚胎经 PCR鉴定后移植，性别准确率 100％．5头经性别 控制的试管牛犊在内蒙古大学出生，标志着我国的性别鉴定 技术已直用于生产。尽管人们做了大量的工作，也取得了一定 成果 ，但距离对性别进行有效控制或使用胚胎性别鉴定达到 实用水平还有一定差距 ，因各种实用性 因素如需求 、成本 、时 间 、数量和准确性限制 了实验室性别控制技术的应用 ：今后应 该在对性 别决定更深的研究成果基础上，着重那些快速 、准 确 、经济的胚胎性别鉴定方法 ，以便将这些技术更好地应用于 实际，促进畜牧业的发展。 体细胞克隆的发展 ，给性别控制另辟溪径 ，一旦 克隆技 术成熟 ，性别控制将一蹴而就 ，那 么，传统性别控制技术是否 会随着克隆技 术的发展而退 出历史舞 台，应该不会 ，克隆技 术本身还有许多值得探讨的问题，还有许多未知的因素，例 如 ，克隆技术从生物学意义上是反进 化的 ，因为有性生殖在 进化上的地位高于无性生殖，它使生物能一代代地交换遗传 物质 ，将不断突变产生 的优 良基因进行交换 ，并通过 自然选 择保留下来 ，但克隆产生新生个体 的过程 ，所有 的遗传物质 来源于父亲，缺 少基因的交流 ，供体体细胞 的全套染色体是 否 比生殖细胞存在更多的老化基因也还是未知数。在性别决 定机理之谜还没完全解开之前，传统性别控制方法和克隆技 术将长期共存 参考文献 [1]郭志勤 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