鸡胚性别鉴定研究进展

动物科学与动物医学 2004年 7月第 21卷第 7期(总第 1 09期) 鸡 胚 性 别 鉴 定 研 究 进 展 张爱玲 李斌 韦平 (广西大学，养禽与禽病研究所，广西 南宁 530005) i中藩 类号：S8l4 7 囊犊标识薅：A 囊章编号：i008~938i(2004)07-08l3-03 1 引言 家禽性别控制研究包括性别决定、性别分化、性别鉴定、 性别诱导和性别控制等方面。性别决定与分化本质的发现是 家禽性别研究的重要基础，对鸡胚性别的早期鉴定是对性腺 基因研究的重要内容。 鸡的睾丸和卵巢是由共同的原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)发育而来。种蛋孵化 67 h(性腺分化期)， 中肾开始参与性腺的形成。鸡胚发育的开始阶段，约至5 d左 右，生殖脊还是中性的性腺，此时雄性和雌性的生殖器官在形 态上未发生分化。无性阶段之后(5 d之后)，雄性和雌性性腺 逐渐发生分化。至 6-7 d，雄性性腺开始睾丸的分化，雌性性 腺也开始出现卵巢的分化⋯。 对于性别未分化前性腺是如何形成的，研究者观点不一。 比较一致的看法是有两套机制调控性腺的发育，即性别分化 机制调节 PGCs分化发育成睾丸或者卵巢，而性别决定机制 控制着睾丸或者卵巢发育的正常进行。 2 鸡的性别决定 鸡的性别决定机制目前公认的有以下三种学说。 2．1 性染色体决定学说 Stevens于 19o6年提 出了性别由性染色体决定 ，即个体 的性别取决于受精时雌雄配子所携带的性染色体的类型。在 鸟类中，其性染色体在雌性中为异型，在雄性中为同型。通常 把雌性异型性染色体称为ZW型，雄性为ZZ型。 2．2 常染色体平衡学说 常染色体平衡学说最早是由美国学者 Bridges以果蝇为 提出并证实的。这一理论认为生物的性别是受细胞核 内 染色体上雄性化基因系统与雌性化基因系统的平衡决定的， 哪一类基因系统占优势就会影响胚胎性别的发育。Crew于 1954年提出了鸡的常染色体平衡学说，即鸡的性别决定取决 于性染色体与常染色体的比例 (性指数)。此后，Mecarry和 Abbott在研究鸡的整倍体和非整倍体与性别的关系中发现， 染色体 的组成 为 AAZZZ (A为常染色体 ，Z为性 染色 体 )或 AAAZZZ的个体是雄性，AAAZZW 个体为中间性[23。 而 Halve~on等则报道AAZZW个体也为雄性 ]。这似乎说明 鸡的性别只和A与Z的比例有关，与W染色体无关。若此说 法正确，那么根据常染色体平衡学说，ZO (0示没有染色 体)型染色体的鸡也应该是雌性，但在实际中尚未见到该类型 收稿日期：2004—06—25 的鸡。而雌雄嵌合体的研究提供了有关的证据，现报道的雌雄 嵌合体均是左侧为雌性，右侧为雄性，左、右两侧细胞的性染 色体组成分别为 ZO和 ZZ⋯。Newcomer等认为常染色体数 的 增加使性染色体／常染色体的平衡趋向雌性。据此可以看 出，Z 染色体上含有雄性化基因系统 ，常染色体上含有雌性化基因 系统，增加常染色体将使个体发育趋向于雌性。支持这一学说 的证据 目前仅见于鸡的一些异常性别中。常染色体对性别的 影响只有在其倍数发生变化 的时候才体现 出来 。因此，这一学 说不是鸡性别决定的主要机制。 2．3 TDF学说 在对哺乳动物的性别研究中发现 ，哺乳动物雄性是 由位 于 Y 染 色 体 上 的 一 种 称 之 为 睾 丸 决 定 因 子 (testis determination factor，TDF)的基 因所编码的组织 相容性抗 原 H—Y所决定的。后来又发现这种抗原在异配性别中都存在， 而且将其称为 H—W。但后来 的研究又发现这一抗原在 ZZ个 体中也存在，只是抗原水平低于ZW个体。Muller等研究发 现，染色体型为雄性的小鸡(ZZ)经雌二醇诱导后表现型转为 雌性的小鸡中也有所谓的 H—W 抗原表达 ，表明这一抗原的 存在并不能成为鸡性别决定的主要控制原因 。 3 鸡的性别分化 性别的分化就是由遗传性别翻译成表型性别的过程。脊 椎动物胚胎早期性腺发育具有两性潜能，即可能向两性的任 何一方分化 。一般认为引起哺乳动物性别分化的机制是雄性 特异的Y染色体Sly的表达。Sly只要具有适当的空间和短暂 表达的机会就可以导致一个遗传型为雌性的胚胎出现睾丸的 发育。在无性阶段，基因表达过程中若没有性别分化的依据 时，许多基因在 Sly表达后以雌雄异型的方式表达。 Lillve提出了胚胎分化的激素学说。该学说认为：性染色 体上的定性基因与常染色体上的定性基因的平衡，刺激细胞 形成诱导物质，生殖腺才开始向雌雄两性分化。生殖腺皮质发 育，髓质退化 ，将来即发育成卵巢；反之，髓质发育而皮质退 化，将来则形成睾丸。性腺分化以后，即借助性激素调节副性 征的出现，而且胚胎性腺细胞所形成的诱导物质与成体性腺 所产生的类固醇激素是完全相同的物质 ]。 Witsch等人提出了性腺分化的诱导学说，这一学说认为 性腺皮质产生一种诱导雌性分化的皮质素，髓质产生一种诱 导雄性分化的髓质素，雌雄两性的分化即决定于这两种诱导 物质间的强度对 比，并且认为诱导物质可能是蛋 白质或蛋白 质与类固醇的复合物 ]。Halverson在对一种麻雀的雌雄嵌合 tL．flt-tW,'~：animalscience@china．com huihuiily@hotmail．com ◆ 0。．00◆ ∞究 展∞ ◆ ◆ ∞研 进∞ ◆ 0。．00◆ 维普资讯 http://www.cqvip.com Anima1 Science＆ Veterinary Medi Citie VO1．21 NO．7(Total No．109) 体进行研究后提出，禽类的遗传性别向表型性别的转化与袋鼠 很相似 ，即表型性别一部分是 由细胞 自身决定(即遗传决定)， 而其他部分则是由于细胞问的相互作用，通过激素的调控而决 定的_6．。近年来的研究显示 ：抑制芳香化酶的活性可使雌性的鸡 胚向雄性转化。因为在向雌性转化过程中，芳香化酶对雄性激 素起着重要的作用，该酶目前确定位于鸡的 l号染色体上。 4 性别鉴定 4．1 一般雌雄鉴别方法 哺乳动物最早的性别鉴定是对供体精子染色体的鉴别。 在家禽 中，由于公鸡提供 的精子为同型染色体 ，当种蛋产出后 已是一个多细胞的囊胚或原肠胚。同时，公鸡精子是 同型，不 能象哺乳动物那样依靠异型精子差异控制初生雏的性别，若 在胚蛋早期或孵化前鉴别出受精蛋的性别，其经济意义是很 大的。 按照“蛋的形状与其性别有关”的设想，高际生等曾发现 ： 随着蛋型指数 的增长公雏 比例逐渐增大，母雏相应略减 ；蛋重 在 64 g以下者公雏 比例稍大，以上者母雏比例略高；种蛋 比 重与性别之间没有明显的规律性关系 ；蛋壳细致度 与性别关 系不明显 ，王书和也发现蛋型指数与出生雏鸡性别之 间无显 著相关 。综上研究结果，吕志南等用模糊模式进行蛋重、蛋 形指数及蛋壳密质程度的集合以判定种蛋的性别，其回报拟 合率和实际预报正确率在 93％以上19；。以种蛋的形状判断初 生雏性别的报道较少，且其重复率较低，因此喻传洲等认为， 蛋形指标与其性别无关。但在种蛋入孵后对 3．0-3．5 d的鸡 胚和 4．0～4．5 d的鸭蛋进行强光源透照 ，根据胚胎血管分布 特征可鉴别雌雄，其准确率达70％～90％ 。 4．2 分子水平上的性别鉴定 尽管禽类性腺在形态学上类似于哺乳动物的，但是对禽 类进行与哺乳动物的 Sry类似 基因的鉴定 的尝试是不成功 的。现在一般认为 Sry基因是哺乳动物所特异的，而另有其它 基因引起禽类性腺的性别分化 ，那些基因将以雌雄异型的方 式表达。各研究机构试图使用差异陈列 RT—PCR(differential display reverse transcription—polymerase chain reaction)或代 表性差异分析 (representational difference analysis)等方法鉴 别这些基因 ，这些方法是将发育中的雄性性腺和雌性性腺表 达的基因进行直接对 比而建立的，但是能否准确鉴定雌雄还 是可疑的[ ]。 鸡胚生殖脊出现在3．5 d左右，而在5．5 d才出现性腺分 化。然而，直到 7．5 d或 8 d才可通过形态学方法检查作出可 靠的性别鉴定。为 了研究的目的，在此阶段之前进行雄雌基因 表达的比较研究 ，需要应用分子的方法准确检测性别。一直以 来，早期胚胎的性别鉴定依赖于染色体组型(karyotype)分析。 假如分析大量的大小相似的染色体 ，这种方法费力且不可靠。 自从在雌性特异的 W 染色体上发现一类重复的核酸限制性 内切酶 XhoI的位点序列后，带来了鉴别方法的显著进步。 Tone等用限制性内切酶 XhoI消化从 白来航母鸡提取 的 DNA，获得 了0．7 kb (重复 14 000次 )与 ll kb(重复 6 000 次)的两个重复序列片段，它们均位于w 染色体上 ” 。随后 Saitoh等用相似的方法 ，经限制性 内切酶 EcoRI消化 ，发现了 第三个长为 l2 bp(重复 700～4 000次)的重复片段。EcoRI 家族 与两个 XhoI家族的重复序列 占整个 W 染色体总 DNA 的 70％～90％，这些大重 复片段又由许多串联的结构相似 的 2l bp亚单位构成0 。这些重复序列构成 了W 染色体的异染 色质区域 ，是鉴定 W 染色体的基础。Dvorake等用火鸡胚 的 mRNA构建的 cDNA筛选出与性连锁的 cDNA克隆，这是一 个既位于z染色体又位于w 染色体上的DNA序列，命名为 DZ—MI。DZ—MI非常保守 ，位于 Z和 W 的非配对区段 ，因为在 Z和 W 上的两个序列有差异(可记为 DZMI和 DW—MI)，在电 泳中显示不同特点的带型。在家鸡和野鸡中 ，DZ—MI也表现 出同样的特点。因此，这一序列也可用于性别鉴定 。由于w 染色体比Z染色体小得多 ，因此每个雄性细胞的 DNA含量比 雌性的多 ，这已被用来作为一种禽类性别鉴定方法 ，即用碘化 丙锭对雌性和雄性细胞核进行染色，再用流式细胞仪进行检 测。雄性和雌性 DNA总量的差别随禽种 的不同 ，在 0．6％～ 3．5％之间变化 。 利用性连锁 DNA序列进行家禽性别鉴定，是通过 DNA 印迹杂交(Southern blot hybridization)、细胞原位杂交(In situ hybridization，ISH)或聚合酶链式 反应(PCR)鉴定 W 染色体 来实现的。Uryu等对鸡w 染色体上 XhoI家族的重复序列进 行克隆和测序，用生物素标记的0．7 kb重复片段的重组质粒 为探针，利用杂交技术对白来航鸡进行了性别鉴定。利用原位 杂交技术检测核苷酸序列较方便，无论是用提纯的DNA，还 是细胞，甚至血液进行原位杂交，雌性和雄性都能清楚地鉴定[15 3。 利用以w染色体为特异探针的血液原位杂交，检测出壳后表 现为雄性的嵌合体鸡中的 W 染色体 ，可研究雌性供体胚盘细 胞在雄性嵌合体鸡中的命运。胚盘细胞和精子也能利用原位 杂交进行性别鉴定，促进了混合性别嵌合体的研究，但似乎不 适合鉴定供体胚盘细胞或受体胚的性别。 PCR技术鉴定 5～7 d鸡胚性别的方法 ，Gri街ths等所描 述的基本程序为：第一，根据选定 w染色体上的一段特异序 列，构建一对特异引物，如 447 bp EcoRI位点序列；第二，从 鸡胚细胞样品中提取 DNA，在合适的条件下进行 PCR反应； 第三 ，利用琼脂糖凝胶 电泳检测 PCR产物，同时设定阴性和 阳性对照。如果在预定的位置有一条带 ，且阴性与阳性对照正 常 ，则意味着样品中存在 W 染色体 ，故为雌性 _l 。 尽管这些方法相 比于早期的鉴定性别 的方法是一个显著 的改进，但仍存在许多缺点，如要求分别做区分性别和对照的 PCR反应。Clinton等人(2001)建立了一个快速 、简单、单管的 鉴定性别的方法。与 Gri街ths描述方法不同之处是 ：一是 两对引物分别扩增 w染色体上的一段415 bp的 XhoI位点 重复序列和 l8 S核糖体基因中第 l 267-l 522 nt之间的 256 bp片段 ；二是对照反应与特异反应在 同一管内一次完 成 ；三是 W 重复引物仅从雌性 DNA扩增到一段 415 bp的产 物，核糖体基因引物从雌雄胚均产生了一段 256 bp的产物作 为对照；四是从尿囊液获得的少量细胞也可鉴别雌雄，与从胚 胎组织检测结果 一致_l 。 电 话 ：010—62815657 62818427 62819395 传 真 ：010—6281 1 182 维普资讯 http://www.cqvip.com 动物科学与动物医学 2004年7月第21卷第7期(总第109期) 5 结论 鸡胚性别决定及分化机制控制着鸡胚性腺发育的正常进 行 ，而为了研究鸡胚性腺基 因的表达，需要准确鉴定性别 的鸡 胚组织。鸡胚雌雄的鉴定已发展了各种方法 ，根据种蛋的模糊 模式方法不能准确鉴定性别 ，鸡胚发育到 7．5 d和更大时可通 过形态学方法检查性腺做出准确鉴定。为了一些需要在更早阶 段分离雌雄的研究，每个鸡胚必须通过分子生物学方法鉴定。 雌性 W 染色体长期以来 已成为鉴定性别的基础。如果 DNA 已经纯化 ，采用 DNA印迹杂交鉴别较方便。细胞原位杂 交不必提纯DNA，但准备工作费时费力。一些商业产品和试 剂盒简化了其中很多步骤 ，使其应用领域在不断扩大。荧光原 位 杂交(fluorescence in situ hybridization,．FISH)更加 简单 、 安全，更适合于亚细胞标记，即检测染色体上的核酸序列。目 前，这些检测方法的应用，因费用高而受到限制，很多实验室 仍以同位素探针为主。利用 PCR技术鉴定性别，灵敏准确，只 需微量样品且 DNA不需纯化 ，尤其是在需要大量胚胎的试验 中更为适用。家禽染色体水平上的性别鉴定 ，PCR技术是一 种最简单 、快速的方法。 参考文献 [1]李碧春，陈国宏，赵东伟 ，等．鸡胚 PGCs迁移与性腺发育关系的 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