血浆凝固酶阴性葡萄球菌的简易鉴定

286 临床检验杂志 2008年第 26卷第 4期 Chinese Journal of Clinical Laboratory Science，2008，Vo1．26，No．4 文章编号：1001-764X(2008)04-0286-02 中图分类号：R446．5 文献标识码：A ·实验技术 · 血浆凝固酶阴性葡萄球菌的简易鉴定 田刚。，李清 ，古丽娜尔·依明 ，张丽萍 ，王金良 (1．天津公安医院检验科，天津300040{2．新疆自治区中医院检验科； 3．新疆喀什地区第一人民医院检验科 ，新疆喀什 844000) 摘要：目的 为鉴定血浆凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)提供简易的鉴定法。 应用细菌的酶和对抗生素的敏感性，优选出 8项试验并制成鉴定板。结果 经检查 100株 CNS，其结果与用 ATB Expression自动细菌鉴定系统的符合率达95％，尚能鉴 定ATB Expression不能鉴定的斯氏葡萄球菌。结论 简易鉴定法简易实用，结果可靠，能检出耐甲氧西林的葡萄球菌以及有 效地区分微球菌和葡萄球菌。 关键词：血浆凝固酶阴性葡萄球菌；鉴定法 血浆凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)引起的感染日 益增多，是医院内感染 的重要细菌。人类感染的 CNS已达 13种之多。国内外对 CNS鉴定尚缺乏统 一 的规程和鉴定法。我们优选了 8项试验并制成 CNS鉴定板，取得明显效果，报告如下。 1 和方法 1．1 碱性磷酸酶试验 pH 8．4～9．0 PBS溶解对 硝基酚磷酸二钠盐浓度为 1．0 g／L。黄色为阳性，无 色为阴性。 1．2 3-半乳糖苷酶试验 pH 7．0～7．4 PBS溶解 邻位．硝基苯．B-D-吡喃半乳糖苷 (ONPG)浓度为 1．0 g／L(英 国 Koch-Light Laboratory)。黄色为 阳 性，无色为阴性。 1．3 脲酶试验 用柯氏尿素培养基⋯。粉红色为 阳性，橙色为阴性。 1．4 VP试验 用葡萄糖蛋白胨水培养基；50 g／L 仅萘酚无水酒精溶液(VPI)和 400 g／L KOH溶液 (VP11)为显色剂。红色为阳性，橙色为阴性。 1．5 红霉素耐药性试验 1 ml乳糖红霉素水 溶液。混浊为阳性，透明为阴性。 1．6 新生霉素耐药性试验 50 ml新生霉素水 溶液(英国 BDH)。混浊为阳性，透明为阴性。 1．7 多黏菌素 B耐药性试验 3 000 U／ml(6 mg／20 m1)多黏菌素 B水溶液 (英 国 Glaxo Lab)。 混浊为阳性，透明为阴性。 1．8 Oxicillin敏感性试验 50 ml的苯唑青霉 素钠，以含 40 g／L NaC1的 pH 7．0～7．4的 PBS配 制。混浊为阳性，透明为阴性。 1．9 菌悬液用营养液 1O L蛋 白胨、5 L NaC1，用 0．1 mol／L NaOH调 pH 7．4～7．6，分装入 安瓿，每瓶 1．2 ml封口后高压灭菌。 1．10 菌株来源 本院贮存的已知菌株及 2004年 以来临床分离的 CNS共 100株。 1．11 鉴定方法 用 10 x4孔的无菌洁净塑料板把 8种试剂依表 1顺序分别加入，每孔 100 l。置 37 c【=温箱烘干(12～16 h)。加盖封固置 4 c【=冰箱保 存；选玻片法血浆凝固酶试验阴性和革兰染色镜检 形态典型的CNS；挑取待鉴定的菌落 1～2个，均匀 混悬于蛋白胨液中，浊度达麦氏0．5单位的；以 无菌系统将菌液加入鉴定板各孑L中，每孑L 100 l振 动使与底物混匀，第九孑L为菌液对照；把加好菌液的 塑料板放入37℃温箱，盖好塑料板盖培育 l8～24 h 后取出；依照表 1判定试验结果。 2 结果 2．1 用 CNS简易鉴定法与 ATB Expression自动微 生物仪鉴定结果对照 利用 CNS简易鉴定法对 100 株 CNS进行鉴定 ，同时利用 ATB Expression自动微 生物仪进行验证 ，其结果见表 2。可见，利用 CNS简 易鉴定法的鉴定结果与用 ATB Expression的符合率 为 95％，而且 CNS简易鉴定法鉴别出了 ATB Ex- pression所不能分辨的斯氏葡萄球菌。 2．2 碱性磷酸酶试验最适条件的观察 用已知碱 磷酶试验阳性菌株，经 10次碱磷酶试验，得出最佳 观察结果时间为 10～12 h。判读结果时以此时间为 宜。对比pH 8．4、8．6、8．8、9．0的 PBS，以 pH 8．8 的PBS颜色最为明显。 2．3 ONPG试验最佳条件的观察 最佳判读结果 时间为8～10 h。对比pH 7．0、7．2、7．4 PBS，结果 以pH 7．2的 PBS显色最佳。 2．4 脲酶试验最佳观察结果时间 最佳判读结果 作者简介：田刚，1969年生，男，生化与分子生物学硕士，副主任技师，从事临床检验及分子生物学研究。 维普资讯 http://www.cqvip.com 临床检验杂志 2008年第 26卷第 4期 Chinese Journal of Clinical Laboratory Science，2008，Vo1．26，No．4 287 时间为反应后4—6 h。 2．5 重复性试验 用确定浓度的8种试验试剂，经 反复 5次配试，试剂一致性达 100％，用已知的表 皮、腐生、模仿、溶血葡萄球菌4种菌株，在鉴定板 上进行l0次重复性试验，重复率达90％。 表 1 重要的葡萄球菌鉴定反应 脲酶 VP 耐 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 溶血葡萄球菌 里昂葡萄球菌 斯氏葡萄球菌 腐生葡萄球菌 中间葡萄球菌 家畜葡萄球菌 头部葡萄球菌 华纳葡萄球菌 孔氏葡萄球菌 木糖葡萄球菌 人型葡萄球菌 解糖葡萄球菌 模仿葡萄球菌 耳葡萄球菌 + + + 一 d + 一 一 + 一 + + 一 一 一 一 一 J- — ． 一 — ． — ． d 一 + + + 一 + 一 一 一 + + + 除微球菌 + + + + + 一 敏感步 其 一 + + 一 d 一 他都耐药 — — — — — ． — ． — ． d 一 一 一 一 + + — — — — — — — — — ． d 一 一 d + + d — — — — — ． — ． d — ． — ． d —． —． 一 一 一 + + d 一 一 山 一 一 一 d 一 决定 MRS + 或 MSS 注：+表示阳性；一表示阴性；d表示不确定。 表 2 CNS简易鉴定法与 ATB Expression鉴定结果 (株) 方法 表皮 腐生 溶血 斯氏 模仿 华纳 人型未确定 CNS简易鉴定法 51 28 10 2 1 3 1 4 ATB Expression 50 31 10 不能辨别 1 2 1 5 2．6 效期的观察 保存在4℃冰箱中的 CNS鉴定 板，经半年使用观察，其有效期限至少半年。 3 讨论 对 CNS的进一步鉴定，Kloos和 Schleifer提出 的鉴定程序多应用糖的发酵试验，结果易有变 异 。我们选择的8种试验能有效的鉴别致人类感 染的 l3种 CNS。本法与用 ATB Expression的符合 率为95％，不符合的鉴定结果经与简易鉴定法 应用 CNS的酶试验所采用的温育时间长短、结果判 读人为误差等有一定的关系。这也是简易鉴定法今 后进一步完善之处。CNS简易鉴定法最大的特点就 是能准确地区分耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)和甲 氧西林敏感葡萄球菌(MSS)，同时能鉴定 出 ATB Expression自动微生物仪不能分辨的斯氏葡萄球菌。 葡萄球菌和微球菌的鉴别，以往只依据镜下的 形态，准确率低。我们在CNS简易鉴定法中应用红 霉素耐药试验。在葡萄球菌属中，耐红霉素都是葡 萄球菌，对红霉素敏感的都是微球菌，是鉴定两者的 决定性实验。 另外简易鉴定法中碱磷酶、ONPG、脲酶试验温 育时间不应过长，否则会出现假阳性，操作中应予以 注意。碱磷酶、ONPG、脲酶试验最佳观察结果时间 分别为 l0—12 h、8～10 h和4～6 h。这些试验结果 在最佳时间判读后，鉴定板继续放回温箱培育。待 试验最终结束时，再判读其他5项试验结果。 总之，简易鉴定法有以下优点：①选用细菌的酶 与耐药性作为鉴别试验，有别于 Kloos和 Schleifer 的鉴定，后者应用糖发酵试验结果的变异性大。 ②底物干燥后可至少保存半年，可随时使用，简易方 便。③结果判定界限明显，易于掌握，可鉴定 l3种 感染人的CNS。④可有效鉴别对甲氧西林耐药或敏 感的菌株。⑤可有效地区分葡萄球菌与微球菌。 参考文献： [1]张秀珍．当代细菌检验与临床[M]．北京：人 民卫生 出版社， 1998．404-405． [2]王金良．血浆凝固酶阴性葡萄球菌的鉴定与临床意义[J]．国外 医学生物化学与临床检验学分册，2005，32(2)：19-21． (收稿日期：2008-01．17，修回日期：20084)4-29) (本文编辑：杨林) 维普资讯 http://www.cqvip.com