葡萄球菌血浆凝固酶试验方法的研究

『I1华临床医药 2004年第 5卷第 3期 Journal of Chinese Clinical Medicine ， 2004，v0J．5， No．3 葡萄球菌血浆凝固酶试验的研究 陈 俊， 陈 伟， 林新华， 黄丽英 (福建医科大学药学系，福建 福州 350004) 摘要：目的 探讨不同抗凝剂抗凝的人血浆及其不同浓度、不同冷藏时间对葡萄球菌血浆凝固酶试验的影响。方法 用 3种不 同抗凝剂 (EDTA—K 、肝素钠、枸橼酸钠)抗凝的人血浆及不同稀释度、4℃冷藏不同时间的人血浆对 135株 G 葡萄球菌进行血 浆凝固酶试验，比较其试验结果。结果 3种不同抗凝人血浆凝固酶实验结果一致，1：2稀释度的人血浆试验结果最佳，血浆 冷藏 4周之内不影响实验结果。结论 3种不同抗凝人血浆都可用于血浆凝固酶试验，血浆 1：2稀释后的实验结果最佳，冷藏 4周之内对实验结果无影响。 关键词：葡萄球菌；血浆凝固酶试验；抗凝剂 中图分类号 ：R378．1 文献标识码：A 文章编号：1562—9023(2004)一03—0007—02 Research on plasma coagulase test for staphylococci from clinical materials CHEN Jun，CHEN Wei，LIN Xin·hua，et al(Department of Phamaceutical，Fujian Medical University，Fuzhou 350004，China) Abstract：Objective To explore the effects of different anticoagulants and different concentration，different cold storage time on the results of the plasma coagulase test f0r staphycoccus．Methods On the standard procedure．to study the effects of three different anticoagulants，including EDTA—K2，sodium heparin and sodium citrate，different plasma concentration and different cold storage time of human plasma on the results ofthe plasma coagulase test ror I 35 strain staphylococci、Results There were no differences between the three different human plasma on coagulase test fi)r staphylococcus，one to two—lbld dilution of human plasma was the optimal concentration for test．plasma store at 4~C for four weeks didn’t effect the results of the test．Conclusion Three different plasma approve to be suitable for the plasma coagulase test for staphylococcus，one to two-fold dilution of human plasma was the optimal concentration for test．plasma can be stored at 4~C for at least lbur weeks f0r test． Key¨rOds：ScaphyIOcOccus： Plasma coagulase test：Anticoagulant 近年来临床感染的病原微生物以革兰阴性菌 居多，但革兰阳性菌仍占相当比例。在革兰阳性 菌中葡萄球菌检出率最高，葡萄球菌感染常可引 起感染部位组织的化脓 、坏死和脓肿形成。目前 葡萄球菌已被命名的有 27个种，但引起临床感染 的最常见葡萄球菌是金黄色葡萄球菌 (金葡)， 皮葡萄球菌 (表葡)和腐生葡萄球菌 (腐葡)3种。 在实验室常规鉴定过程中，血浆凝固酶试验为鉴 定革兰氏阳性葡萄球菌的主要试验之一。鉴定过 程中首先用血浆凝固酶试验将葡萄球菌分为凝固 酶阳性的金葡菌和凝固酶阴性的其它葡萄球菌， 然后通过新生霉素敏感试验区分表葡和腐葡，确 定感染菌，从而指导临床合理有效应用抗生素， 以取得最佳治疗效果。本文旨在探讨不同抗凝剂 抗凝的人血浆其凝固酶实验效果有否差别，以及 血浆不同稀释度 、4℃冷藏保存时间对试验结果有 何影响。 1 材料和方法 1．1标准菌株 金黄色葡萄球菌 (ATCC25923)，大 肠埃希菌 (ATCC25922)均为厦门中山医院检验科微 生物室保存的菌株。 1．2标本来源 2000年 6月一2001年 6月厦门中山 医院门诊和住院病人各类标本 (除粪便外)检出的 G 葡萄球菌 135株。 1．3血浆 用湖南省浏 阳市医用仪具厂生产的 EDTA—K 、肝素钠、枸橼酸钠抗凝管系列严格按照说 明采集健康体检者静脉血，3000转／min离心 5min 后分离获得 3种血浆。 1．4方法 ①各类标本用梅里埃 VITEK32细菌鉴定 仪鉴定，鉴定的 G’葡萄球菌经分离纯化后进行血浆 凝固酶试验。②血浆凝固酶试验 用生理盐水将血 浆 1：4稀释后，取 0．5ml于小试管中，然后挑取 5～8 个菌落置于稀释的血浆中，制成浓菌悬液，轻摇混 匀后，置 37*(2水浴，同时以 ATCC25923作为阳性 对照，以 ATCC25922作为阴性对照，以生理盐水作 为空白对照。温育 4—6h后观察结果，凝固者判为阳 性，若不凝固，继续观察到 24h，不凝固者判为阴 性。以见到明显的纤维蛋白凝胶块判为葡萄球菌血 收稿 日期 ：2003一10—20；修回日期：2003—1卜22 维普资讯 http://www.cqvip.com 8。 中华l临床医药 2004年第 5卷第 3期 Journal of Chinese Clinical Medicine ， 2004，Vo1．5， No．3 浆凝固酶阳性，出现羊毛状或纤维状沉淀物并非真 正的凝固，应判为阴性。 2 结果 2．1不同抗凝血浆对血浆凝固酶试验的影响 分别 用 EDTA—Kz、肝素钠、枸橼酸钠抗凝血浆进行血浆凝 固酶试验，结果如表 1所示。 表 1 不同抗凝血浆对血浆凝固酶试验的影响 2．2血浆浓度对血浆凝固酶试验的影响 分别用原 倍、1：2、1：4、1：8肝素钠抗凝人血浆进行血浆凝 固酶试验。实验结果见表 2。实验结果表明不同浓度 的血浆对试验 的结果有影响，原倍血浆有些标本 4—6h阳性结果不明显，试验结果不易判读；1：2稀 释管的阳性结果较 1：4稀释管的阳性结果更直观、 更明显；1：8稀释管部分阳性结果会推迟出现，为了 经济、快捷地得到正确的实验结果，选用 1：2稀释 的血浆进行血浆凝固酶试验较为科学。 表 2 血浆浓度对血浆凝固酶试验的影响 原倍 1：2 1：4 1：8 2．3血浆冷藏时间对血浆凝固酶试验的影响 分别 取肝素抗凝新鲜人血浆和 4℃冷藏保存不同时间的 血浆进行血浆凝固酶试验，实验结果见表 3。实验结 果表明 4℃冷藏 卜4周的血浆与新鲜血浆的实验结 果无差异 。 表 3 血浆冷藏时间对血浆凝固酶试验的影响 3 讨论 3．1现在葡萄球菌的检出率在临床感染菌中居第 2 位，仅次于肠杆菌科细菌，其中血浆凝固酶阳性的 金黄色葡萄球菌占相当比重，金葡菌系毒力很强的 致病菌，无论从何标本中分离均应进行鉴定，进行 药敏试验并尽快报告临床。血浆凝固酶试验是实验 室鉴定金葡菌和其他凝固酶阴性的葡萄球菌的主要 试验之一⋯，血浆凝固酶是金葡菌所产生的，与其致 病力有关的一种侵袭性酶，其作用是使血浆中的纤 维蛋白在菌体表面沉积和凝固以阻碍吞噬细胞的吞 噬。传统概念血浆凝固酶试验用玻片法检测，而现 代概念玻片法是检测葡萄球菌的凝聚因子、试管法 检测血浆凝固酶，凝固酶试验不能用玻片法代替试 管法，否则会把凝固酶阴性的葡萄球菌鉴定成凝固 酶阳性的葡萄球菌，同时也会漏检凝固酶阳性的葡 萄球菌。因而试管法是鉴定葡萄球菌血浆凝固酶存 在与否的确诊试验 。 3．2对于血浆凝固酶试验，各种动物血浆的试验效 果不同，以兔血浆最好 ’ ’ ，人血浆也可使用 ， 在实验室常规操作中人血浆方便易得，因此一般选 用人血浆进行试验，而选用何种抗凝剂抗凝的人血 浆实验效果最佳，目前各种书籍及文献尚无一致观 点 ’ ，本实验用 EDTA—Kz、肝素钠、枸橼酸钠抗 凝的 3种人血浆同步进行血浆凝固酶试验，结果表 明不同抗凝剂抗凝的人血浆试验结果一致，因此这 3 种血浆都可以用于血浆凝固酶试验，在临床工作中 完全可以根据医院、科室的实际情况选择血浆 。 EDTA—K 、肝素钠、枸橼酸钠 3种抗凝剂抗凝机制不 尽相同⋯ ，但都不会影响纤维蛋白的含量与聚集， 因而 3者的血浆凝固酶试验结果没有差别。 3．3金葡菌能分泌血浆凝固酶，它作用于纤维蛋白 原，使之转化为纤维蛋白，导致血浆凝固，从而呈 现阳性结果，血浆中的纤维蛋白含量是保证该试验 准确性的主要因素，因此用少纤维蛋白原的血浆进 行试验可出现假阴性⋯ ：本试验通过比较，得出不 同浓度的血浆对试验的结果存在影响，原倍血浆试 验结果不易判读，1：2稀释管的阳性结果较 1：4稀 释管的阳性结果更直观，1：8稀释管部分阳性结果会 推迟出现，因此选用 1：2稀释的血浆进行试验较为 科学、经济。 3．4纤维蛋白是相对稳定的凝血因子，它的活性在 4 ℃保存的血浆中可保存一段时间，本实验用 4℃保存 卜4周的血浆和新鲜血浆进行对比试验，试验结果无 差异，所以在实验室中可用新鲜血浆或 4℃保存的血 浆进行血浆凝固酶实验，但应保证其中的纤维蛋白 活性。 参考文献： [1] 叶应妩，_下毓二．伞国临床检验操作规程[M]．第 2版． 南京：东南大学出版社，1997，478 [2] 蔡文城，实用临床微生物诊断学[M]．南京：东南大学 出版社，1998，302 [3] 单保恩， 秀珍，张金艳．不同种属各加不同抗凝剂 的血浆对金黄色葡萄球菌凝固酶试验结果的影响[J]． 河北医学院学报 ，1994，15(1)： ll一13 [4] Jean F，Mal Faddin．Biochemical Tests for Medical Bacteria[M]．Baltimore USA：T Wiikins Compaany， 1976，41—51 (下转 ll页) 维普资讯 http://www.cqvip.com 中华临床医药 2004年第 5卷第 3期 Journal of Chinese Clinical Medicine ， 2004，v0I．5， No．3 ．11． 氨酸酶的mRNA水平。李洪武等 应用RT—PCR技术 the albino phenotype by introduction of a 证明了茯苓和白术能在基因转录水平下调酪氨酸酶 functional tyrosinase gene into mice ． EMBo T． mRNA的表达。雷铁池等 也曾用 RT—PCR证明毛喉 1990。9(9)：2819—2826 素是通过在转录水平上上调酪氨酸酶基因表达而使 [1o] Schmutz SM，Moker JS ． In situ hybridization 8-MOP诱导的黑色素生成明显增强。本实验用该技 mapping of TYR and CCNDI to catt1e chromosoⅢe 术研究发现上调酶活性的 7种中药能使酪氨酸酶 29．Anim Genet，1999，30(3)：241—242 mRNA水平增高，提示其使黑素生成增加与其在转录 [11]Stjernschantz J，Ocklind A，Wentze1 P，et a1 ． 水平上的作用有关。 LatanoDrost—induced increase of tyrosinase 补骨脂外用对白癜风具有一定疗效 ，本实验 transcription in iridia1 melanocytes．Acta 用作阳性对照，亦显示其对酪氨酸酶 mRNA表达的促 Ophtha1mo1 Scand，2000 Dec。78(6)：618～622 进作用。此外，还发现旱莲草等中药对酪氨酸酶mRNA [12] Virador V，Matsunaga N，Matsunaga J，et a1． 促进作用更强，可供临床用药的参考，并值得进一 Production of melanocyte—specific antib0dies 步研究。 to human melanosomal proreins：expression 参考文献： patterns in normal human skin and in cutaneous [1] 雷铁池，朱文元，夏明玉．89味中药乙醇提取物对酪 pigmented lesions．Pigment Cel1 Res，2001，14(4)： 氨酸酶活性的上调作用 [J]．中华皮肤科杂志，1998， 289-297 28 (3)： 147—149 [13] Suzuki I，Kato T，Motokawa T，et a1．Increase of [2] 刘之力，涂彩霞，任风，等．56味中药乙醇提取物对 pro～opiomelanocortin mRNA prior to tyrosinase， 酪氨酸酶活性影响及动物致色素作用的研究[J]．中 tyrosinase—related protein 1，dopachrome 华皮肤科杂志，2001，34(4)：284—285 tautomerase，Pmel一17／gplO0，and P-protein mRNA [3] 林 CFA(孔庆雷译)．组织病理学与组织化学技术手 in human 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