卵巢癌抗独特型单链抗体6B11基因在大肠杆菌中的高效表达

·基础研究· 作者单位 :100034 　北京医科大学人民医院妇科肿瘤中心 (刘玉 英、钱和年、冯捷、崔恒) ;中国科学院遗传学研究所 (黄华梁) 卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11 基因 在大肠杆菌中的高效表达 刘玉英 　钱和年 　黄华梁 　冯捷 　崔恒 　　【摘要】　目的 　制备在大肠杆菌中高效表达 6B11 卵巢癌抗独特型单链抗体。方法 　采用聚合 酶链反应 (PCR)克隆技术 ,将 6B11scFv基因克隆到原核高效表达载体 pKPL23a 上 ,重组子转化大肠杆 菌 pop2136 ,温度诱导表达 ;复性蛋白经二乙氨乙基琼脂糖快速离子交换层析纯化 ,十二烷基硫酸钠2 聚丙烯酰胺凝胶鉴定蛋白纯度 ;直接法和竞争抑制法 ELISA 检测其活性。结果 　6B11scFv 以包涵体 形式表达获高效表达 ;包涵体经溶解复性纯化 ,纯度达 95 %以上 ;表达蛋白能与卵巢癌单抗 COC166 - 9 特异结合并能有效抑制卵巢癌抗原 OC166 - 9 与卵巢癌单抗 COC166 - 9 的特异结合。结论 　 6B11scFv基因可在原核细胞中高效表达 ,表达产物经复性纯化后具有较好的免疫活性。 【关键词】　卵巢肿瘤 　　抗体 ,抗独特型 　　基因表达 High2level expression of 6B11 ovarian carcinoma anti2idiotypic antibody scFv genes in E. Coli 　LIU Yuying3 , QIAN Henian , HUANG Hualiang , et al . 3Gynecologic Oncology Center , People′s Hospital Beijing Medical University , Beijing 100034 【Abstract】　Objective 　To express high2level 6B11 ovarian carcinoma anti2idiotypic antibody single chain Fv (scFv) genes in E. Coli. Methods 　Using PCR cloning technique , We cloned 6B11scFv genes into bacterial expression vector pKPL23a. Recombinant plasmid vector pL26B11scFv was transformed into E. Coli pop2136 with temperature control to produce proteins. Renaturated proteins were purified on DEAE2Sepharose Fast Flow ion exchange column with salt gradient elution. Immunoactivity was determined with ELISA and inhibition ELISA tests respectively. Results 　6B11scFv genes were expressed as inclusion bodies in the cytoplasm. The purity of 6B11scFv turned out by SDS2PAGE was more than 95 %. The expressed proteins after purification specifically reacted with anti2ovarian carcinoma monoclonal antibody COC16629 and efficiently inhibited the reaction between primary ovarian carcinoma antigen OC16629 and COC16629. Conclusion 　We successfully expressed high2level 6B11scFv genes in E. Coli. Expressed proteins showed pretty good immunoactivity. 【 Key words】　Ovarian neoplasms　　Antibody , anti2idiotypic 　　Gene expression ( Natl Med J , China 1999 ,79 :2212223) 　　卵巢癌抗独特型抗体 6B11 能模拟卵巢癌抗原 诱导动物体内产生特异性抗肿瘤免疫应答[1 ] 。为降 低其鼠源性 ,本中心已成功制备了基因工程抗独特 型单链抗体 (6B11scFv) [2 ] 。但其表达量较低 ,限制 了进一步研究和临床应用。本研究旨在采用聚合酶 链反应 (PCR)克隆技术 ,选择高效表达载体 ,高效表 达有免疫活性的 6B11scFv ,为卵巢癌免疫防治提供 基础。 材料与方法 　　1. 质粒和菌株 :pCANTAB5E26B11scFv 为本中心 构建。原核高效表达载体 p KPL23a (3. 6 kb 含 PL 启 动子 ,一个天然 SD 序列 ,一个人工 SD 序列 ,Nco Ⅰ,Xba Ⅰ等酶切位点及终止子) 以及大肠杆菌 pop2136(含 CI857 基因 ,编码温度敏感性λ阻遏蛋白) 均为北京医科大学免疫学系马大龙教授惠赠。2. 抗原和抗体 :卵巢癌组织抗原 OC166 - 9 及卵巢癌单克隆抗体 COC166 - 9 为本中心制备。3. 6B11scFv 基因的 PCR 扩增 :根据 6B11scFv 全序列[2 ] ,设计 5′和 3′一对引物 ,为便于重组 ,在 5′引物 5′端加上 Nco Ⅰ酶切位点 ,因其内含 ATG起始密码 ,为保证读码框架一致 ,在酶切位点后加上 2 个碱基 G和 T ,使 ATG后第一个氨基酸为甘氨酸 ;在 3′引物的 5′端加上 Xba Ⅰ酶切位点及终止密码 TAA。 5′引物 :5′2CTCCATGGGTCAGGTCAAACTGCAGGAGTC23′, 3′ 引 物 : 5′2GCTCTAGATTACCGTTTTATTTC CAACTTTGTCC23′。引物由美国 Cybersyn 公司合成。 ·122·中华医学杂志 1999 年 3 月第 79 卷第 3 期　Natl Med J China , March 1999 , Vol 79 , No. 3 以 pCANTAB5E26B11scFv 为模板 ,首次变性 95 ℃5 分 钟后 ,进入 PCR 循环 :60 ℃90 秒 ,72 ℃120 秒 ,95 ℃50 秒 ,共 30 个周期 ,最后 72 ℃延伸 7 分钟。 4. 高效表达质粒 pL26B11scFv 的构建与鉴定 :将 纯化 PCR 产物用 Nco Ⅰ和 Xba Ⅰ消化 ,在 T4DNA 连 接酶的作用下 ,连入经相同内切酶消化的 p KPL23a 中 ,获得含 6B11scFv 全序列的质粒 pL26B11scFv。将 重组质粒分别用 Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和 Bgl Ⅱ酶切 ,1 kgΠL 琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段的大小 ;将重组质粒 中的目的基因 6B11scFv 亚克隆到 PUC19 中 ,由美国 Cybersyn 公司自动测序。 5. 重组质粒的诱导表达、蛋白复性及纯化 :将含 有重组质粒的大肠杆菌 pop2136 在 30 ℃活化 ,1∶100 稀释后继续扩增培养至A600 约为 0. 4 时 ,立即 42 ℃ 诱导 4～6 小时后收集菌体。超声破碎细菌细胞分 离包涵体 ,包涵体经反复洗涤后用 8 molΠL 尿素变性 溶解 ,加入复性液[ 50 mmolΠL 三羟甲基氨基甲烷2盐 酸 ( Tris Cl ) , 1 mmolΠL 依地酸 , 1 mmolΠL PMSF , 5 mmolΠL 二硫化谷胱甘肽和 0. 5 mmolΠL 谷胱甘肽 ]稀 释复性 ,10 ℃复性 48 小时。聚乙二醇浓缩后 ,对 20 mmolΠL Tris Cl (pH 8. 0) 、0. 5 molΠL 尿素透析平衡。 采用二乙氨乙基琼脂糖快速离子交换剂 (瑞典 Pharmacia 公司产品)离子交换层析柱纯化浓缩后复 性蛋白 ,十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS2PAGE)其纯度。 6.表达蛋白的活性检测 :采用直接法 ELISA 和 竞争抑制法 ELISA 检测活性[3 ] 。 结 果 　　一、6B11scFv 基因 PCR 扩增 根据 6B11scFv 基因全序列设计一对引物 ,以 pCANTAB5E26B11scFv 为模板 ,30 个循环后 , PCR 产 物经 1 kgΠL 的琼脂糖凝胶电泳检测 ,在 780 bp 左右 有一特异性扩增带 ,为 6B11scFv 基因片段 (图 1) 。 1、216B11scFv DNA ;31 相对分子质量 (Φ 174DNAΠHae Ⅲ 为 1353、1078、872、603 及 310 bp) 图 1 　6B11scFv 基因 PCR 扩增后 1 %琼脂糖凝胶电泳 11 相对分子质量标准 (相对分子质量为 94 000、67 000、43 000 及30 000) ;21 诱导前 ;31 诱导后 ;41 超声破碎后上清 ; 51 包涵体洗涤上清 ;61 包涵体 ;71DEAE2Sepharose FF 纯化带 图 2 　SDS2PAGE鉴定 6B11svFv 表达和纯化 二、6B11scFv 高效表达克隆的构建及其鉴定 6B11scFv 基因插入 p KPL23a 的 Nco Ⅰ和 Xba Ⅰ 酶切位点 ,重组表达载体为 pL26B11scFv。重组质粒 经 Nco Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切 ,切下 780 bp 左右 DNA 片 段 , 与 6B11scFv 片段大小一致 ; Bgl Ⅱ仅位于 6B11scFv轻链可变区基因大约 70 bp 位置 ,重组质 粒经 Nco Ⅰ和 Bgl Ⅱ双酶切 ,切下约 500 bp DNA 片 段 ,与理论计算的片段大小相符合。 为确定重组质粒中目的基因读码框架及序列是 否正确 ,对重组质粒中的 6B11scFv 目的基因片段继 续 DNA 序列分析表明 ,DNA 序列与原序列相同且读 码框架完全正确。 三、表达的 6B11scFv 蛋白分析 pL26B11scFv 转化大肠杆菌 pop2136 ,温度诱导 后 ,6B11scFv 以包涵体的形式获高效表达 ,在相对分 子质量为 28 000 处有浓表达带 (图 2) ,表达量占菌 体蛋白的 30 %以上。包涵体分离溶解复性后 ,经离 子交换层析纯化 ,0. 12 molΠL 洗脱峰是表达蛋白 , SDS - PAGE分析 ,纯度可达 95 %以上。 四、表达蛋白质的活性检测 直接法 ELISA 检测 ,纯化后表达蛋白质孔的 A490 值高于阴性对照的 3 倍以上 ,当辣根过氧化物 酶标记的卵巢癌单克隆抗 COC166 - 9 ( HRP - COC166 - 9) 为 1∶500 稀释时 ,纯化表达蛋白质浓度 在 5 mgΠL 左右时 ,A490 值接近于阳性对照。 竞争抑制法 ELISA 检测 ,纯化后表达蛋白质 6B11scFv 能特异性竞争卵巢癌抗原 (OC166 - 9)与卵 巢癌单克隆抗体 (COC166 - 9) 的结合 ,其抑制率达 67 %。 讨 论 　　卵巢癌在妇科恶性肿瘤中死亡率居首位 ,采用 ·222· 中华医学杂志 1999 年 3 月第 79 卷第 3 期　Natl Med J China , March 1999 , Vol 79 , No. 3 手术、化疗及放疗 5 年生存率仍较低 ,徘徊在 30 % ～40 % ,生物治疗为卵巢癌的治疗提供了一条新的 途径。因抗原内影像型抗独特型抗体 ,具有模拟抗 原和免疫调节双重作用[4 ,5 ] ,在肿瘤生物治疗中具有 一定的意义。 6B11 为本中心制备的卵巢癌抗原内影像型抗 独特型抗体 ,能诱导同系小鼠产生特异性抗卵巢癌 免疫应答。为去除鼠抗体异源性 ,本中心利用基因 工程方法克隆和表达了 6B11 抗独特型单链抗体 (6B11scFv) 。但其表达量低 ,限制了进一步基础和 临床研究。因此 , 高效表达出具有免疫活性的 6B11scFv 蛋白质具有重要意义。 外源基因在大肠杆菌中的表达量与启动子、SD 序列及转录终止子等有关。原核高效表达载体 p KPL23a 具有 PL 强启动子 ,两个 SD 序列及转录终 止子属温度控制诱导表达型 [6 ] 。我们根据已知 6B11scFv 全序列 ,设计并合成了扩增 6B11scFv 基因 的引物 ,在 6B11scFv 基因两端引入Nco Ⅰ和 Xba Ⅰ酶 切位点 ,将其克隆到 p KPL23a 载体上 ,重组子转化大 肠杆菌 pop2136 ,温度诱导以包涵体的形式获高效表 达 ,表达量占菌体蛋白的 30 %以上。 同时对 6B11scFv 表达动态进行了观察 ,不同的 诱导时间及细菌生长状态对表达量有影响 ,当 A600 约为 0. 4 时开始诱导 ,诱导 4～5 小时表达量最高。 与分泌型表达相比 ,包涵体表达的蛋白量更大。 但这种表达形式是没有抗原结合功能的 ,必须经过 复性过程才能得到具有免疫活性的蛋白质。8 molΠ 　　　 L 尿素能使包涵体蛋白质溶解 ,在二硫键还原剂的 作用下 ,错配的二硫键被打开 ,包涵体蛋白被还原成 只具有一级结构形式 ,在谷胱甘肽氧化还原体系中 , 抗体分子正确地形成二硫键 ,折叠成具有抗原结合 能力的单链抗体。包涵体经溶解复性纯化后 ,能与 卵巢癌单抗 COC166 - 9 反应并能有效竞争抑制卵 巢癌初始抗原 OC166 - 9 与 COC166 - 9 的结合 ,说 明表达蛋白能模拟卵巢癌初始抗原 ,具有较好的免 疫活性。 6B11scFv 在大肠杆菌中高效表达的研究 ,为进 一步探讨利用基因工程抗独特型单链抗体作为抗 原 ,引起机体免疫反应 ,提供了必要条件 ,为卵巢癌 免疫防治奠定基础。 参 考 文 献 1 Qian HN , Lu WY. Anti2idiotypic monoclonal antibodies against anti2 ovarian carcinoma monoclonal antibody COC16629. Chin Med J , 1994 , 107 : 992103. 2 张香云 ,钱和年 ,邱并生 ,等 16B11 卵巢癌抗独特型单链抗体表 达及序列分析 1 北京医科大学学报 ,1996 ,28 :25222551 3 刘玉英 ,钱和年 ,黄华梁 ,等 1 以包涵体形式表达的 6B11 卵巢癌 抗独特型单链抗体的复性、纯化和活性研究 1 北京医科大学学 报 ,1998 ,30 :4001 4 Herlyn D , Zaloudik J , Somasundaram R , et al . Anti2idiotype vaccine in colo2rectal cancer patients. Hybridoma , 1993 , 12 : 5152520. 5 Schlebusch H , Wagner U , Gruenn U , et al . A monoclonal antiidiotypic antibody ACA125 mimicking the tumor2associated antigen CA125 for immunotherapy of ovarian cancer. Hybridoma , 1995 , 14 : 1672173. 6 周宝宏 ,马大龙 ,狄春辉 ,等 1 人单核细胞衍生 IL - 8cDNA 的体 外 PCR 扩增及其在大肠杆菌中高效表达 1 中华微生物学和免疫 学杂志 ,1992 ,12 :17421761 (收稿 :1998205204 　　修回 :1998210210) (本文编辑 :刘小梅) 第五次全国微生物与免疫学学术会议征文通知 　　中华医学会第五次全国微生物与免 疫学学术会议将于 1999 年 11 月上旬在 山东省济南市召开。届时将邀请国内外 著名学者及专家作专题。 一、征文内容 微生物学与免疫学基础 :基础免疫 学 (分子、细胞、遗传及生殖等新进展) ; 微生物学新进展、新技术及新方法 ;微生 物与疾病 :分子微生物学、临床微生物 学、微生物学与疾病的诊断和治疗 (包括 肝炎、艾滋病、性病、结核及其他传染性 疾病等) ;免疫学与疾病 :临床免疫学 (肿 瘤、变态反应、感染、移植和自身免疫 等) ;免疫学与疾病的诊断和治疗 (包括 基因诊断和治疗) 。 二、征文要求 未公开发表的学术论文均可投稿 , 并提供全文 (3 000 字) 及文摘 (500 字左 右) ,在标题下写明作者、单位及邮政编 码 ,并附软盘。征文交 20 元稿件处理费 (不要夹在信封里 ,以免丢失) 。稿件经 专家评审后 ,并从中评出部分优秀论文 (全文)及文摘正式出版。被录取者将发 正式参加会议通知。由于人力有限 ,稿 件恕不退稿。截稿日期 :1999 年 7 月 15 日 (以邮戳为准) 。来稿请寄 :北京市东 四西大街 42 号 ,邮政编码 :100710 ;电话 : 65251575 ;中华医学会学术会务部刘亚 君收 (信封上注明“微免”字样) 。 ·322·中华医学杂志 1999 年 3 月第 79 卷第 3 期　Natl Med J China , March 1999 , Vol 79 , No. 3