青贮饲料中乳酸菌的体外抑菌试验及其细菌素的提取

乳酸菌(Lacticacidbacteria,LAB)是能使可发 酵碳水化合物(主要为葡萄糖)产生大量乳酸的细菌 通称。乳酸菌是促进青贮饲料发酵的主要有益微生 物,可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢等多种天 然物质,这些物质除具有杀毒抑菌作用外,还可维 持肠道内菌群平衡。细菌素作为饲料添加剂可以有 两个方面的作用,一是防止饲料本身被致病菌污 染;二是防治致病菌对动物肠道的影响。随着我国 饲料工业的迅猛发展,畜禽生产越来越多地依赖饲 料。本试验以青贮饲料中分离的乳酸菌为基础,对 所分离到的乳酸菌菌株进行体外抑菌试验以及选择 抑菌效果良好的菌株进行细菌素的提取。旨在为开 发应用该菌提供理论依据和菌种保证。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 乳酸菌菌株 来自于安徽农业大学微生物实验室,从自制青 贮料中分离保存10株乳酸菌菌株。分别命名为:S9、 X1、S7、N3、M16、Y17、LM3、LM1、N5、C15。 1.1.2 培养基 MRS培养基,按照参考文献[1]提供的方法配 制;普通培养基自制。 1.1.3 指示菌种 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均购于 中国兽医药品监察所。气单孢菌、蜡样芽孢杆菌为 安徽农业大学微生物实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 乳酸菌菌株的筛选 保存的乳酸菌菌株加入MRS液体增菌液活化, 将活化菌株划线接种于MRS固体培养基中,37℃ 厌氧培养[2]48h。挑取单菌落涂片,革兰染色、镜 检,确定为革兰阳性的短杆状的纯菌种后进行纯培 养,作为测试菌种。 1.2.2 乳酸菌的体外抑菌试验 乳酸菌上清液的制备:将乳酸菌以 5%的接种 量接种到MRS液体培养基中,37℃培养48h, 取 发酵培养液10000rpm离心20min,上清液放冰箱 备用。 指示菌菌液的制备:挑单菌落 1～2个接种于 2mL普通肉汤中,37℃培养18h后,用麦氏比浊 法制成15亿个·mL-1的菌悬液,用于本试验。 乳酸菌抑菌活性测定:采用牛津杯法,将指示 菌液 100μL均匀的涂布于直径为11cm的普通培 养基平板表面,以无菌操作方法在平板表面放置小 牛津杯,再在杯中加入不同浓度的乳酸菌上清液, 置37℃培养8h,取出观察抑菌圈大小并进行测量 和。 酸对乳酸菌抑菌活性的影响:用乳酸调MRS 液体培养基 pH值与发酵上清液的 pH值相同作为 对照,分别测定对照与发酵上清液的抑菌活性。 1.2.3 乳酸菌细菌素的初步提取 粗提细菌素:采用硫酸铵沉淀法制备细菌素粗 收稿日期：2005-11-25 作者简介：王蔚淼(1979-),女,回族,陕西西安人,硕士研 究生,研究方向为兽医微生物及免疫学。 *通讯作者 青贮饲料中乳酸菌的体外抑菌试验及其细菌素的提取 王蔚淼，潘 玲*，周 杰，祁克宗 （安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036） 摘 要：对10株乳酸菌进行了体外抑菌试验，发现乳酸菌对革兰阳性和革兰阴性指示菌均有明显的抑制作 用。10株乳酸菌中X1、LM1、C15三株细菌的抑菌效果最好。选择X1、C15两株细菌进行细菌素的提取以及用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行初步鉴定，发现有明显的电泳条带。 关键词：乳酸菌；体外抑菌；细菌素 中图分类号：S816.3；S816.5+3 文献标识码：A 文章编号：1001-0084（2006）04-0001-03 试验研究 -1- 饲料博览 2006年第4期 指示菌 S9 X1 S7 N3 M16 Y17 LM3 LM1 N5 C15 葡萄球菌 6 13 14 6 6 13 15 17 12 14 沙门氏菌 6 17 14 6 13 6 6 17 15 16 大肠杆菌 13 20 16 6 6 6 16 14 16 17 气单孢菌 14 17 15 13 12 6 20 16 17 18 蜡样芽孢杆菌 15 20 16 13 15 6 15 12 13 16 提蛋白。筛选出抑菌活性较高的 2株乳酸菌菌株, 接种于 MRS液体培养基中,37℃培养 48h。然 后,离心除去菌体得到无细胞发酵液。用NaOH调 节pH至 8.0左右,后加入与原溶液等体积的饱和 (NH4)2SO4,放入 4℃冰箱中沉淀约 2h。后取出 (10000rpm,4℃,20min)离心,弃去上清夜可 得蛋白质沉淀粗提物。用 pH值 6.0的磷酸缓冲液 溶解后,放入-20℃冰箱中备用。 粗提细菌素的透析以及初步鉴定:粗提细菌素 放入透析袋中在磁力搅拌器上搅拌,直至用 BaCl2 检测透析液无白色沉淀产生为止。初步鉴定应用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法[3]。 2 结 果 2.1 乳酸菌菌株的分离及初步鉴定结果 选用 10株乳酸菌,经革兰染色、镜检。保留 革兰染色阳性、杆状细菌,MRS液体培养基中生 长良好,无菌膜,使培养基pH值下降到3.5～5.0。 2.2 乳酸菌体外抑菌试验结果 10株乳酸菌上清液对 5种指示菌的抑菌试验 结果见表1。 表1 乳酸菌体外抑菌结果 （mm） 从表1中可以看出,乳酸菌上清液对革兰阳性 菌和革兰阴性菌都有抑制作用。经过方差得出 乳酸菌上清液对不同指示菌的抑菌效果差异不显著 (P>0.05)。各乳酸菌上清液之间抑菌效果经过方 差分析后,差异显著(P<0.05)。后经多重比较, 用SSR检验得出:其中X1、LM1、C15与S9、N3、 M16、Y17之间差异极显著(P<0.01)。X1、S7、 LM1、C15之间差异不显著(P>0.05);LM3、N5与 S9、N3、M16之间差异显著(P<0.05);S9、N3、 M16之间差异不显著(P>0.05);但 S9与M16差异 显著(P<0.05)。从而可以得出:X1、LM1、C15这 三株细菌的抑菌效果最为明显,S7、LM3、N5次 之,M16菌株的抑菌效果最差。 2.3 选择 X1、C15两株细菌进行细菌素提取的 结果 2.3.1 X1、C15两株上清液对大肠杆菌、腊样芽孢 杆菌指示菌的抑菌效果 结果见图1。 图1 对大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌的抑菌效果 从图1可看出,5株乳酸菌上清液对大肠杆菌 的作用结果中,3、4号菌株分别为 X1、C15,抑 菌效果最为明显。其余乳酸菌的抑菌效果次之。5 株乳酸菌上清液对蜡样芽孢杆菌的抑菌结果中,2、 5号菌株分别为X1、C15,抑菌效果最为明显,其 余乳酸菌的抑菌效果次之。图 1中 1号为乳酸对 照,无明显抑菌效果,可以排除乳酸对抑菌效果的 影响。因此选用X1、C15进行细菌素的提取。 饲料博览 2006年第4期 -2- 试验研究 2.3.2 X1、C15两株细菌细菌素SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳 结果见图2。 从图 2中 1泳道牛血清白蛋白、2泳道X1、3 泳道C15电泳图谱可以看出,X1、C15两株细菌所 含细菌素分子质量大小约相等,均小于牛血清白蛋 白的分子质量。而且银染色的灵敏度明显高于考玛 斯亮兰染色。 3 讨 论 a.据相关资料报道,大多数青贮饲料中的乳 酸菌主要是植物乳杆菌、短乳杆菌[4]。因此,筛选 乳酸杆菌作为饲料等物品的添加剂进行研究是十分 必要的。本试验从微生物实验室保存的17株乳酸 菌中初筛出 10株镜检为杆状的乳酸菌菌株进行研 究。 b.乳酸菌在生长过程当中,可以抑制环境中 其他有害微生物的生长。本试验选择了5种指示菌 进行体外抑菌试验,发现乳酸菌上清液对革兰氏阳 性菌和革兰氏阴性菌都有抑制作用。这与有些报道 乳酸菌对革兰氏阳性菌有明显的抑菌效果而对革兰 氏阴性菌没有抑菌效果的结果不相一致。笔者认为 是与所选乳酸菌种属的差异和乳酸菌所产细菌素种 类的不同有关。 c.乳酸菌细菌素是细菌通过核糖体合成机制产 生并分泌到环境中的一类对同种或亲缘关系较近的 种有抑菌活性的低分子质量的蛋白或多肽类物质。 本文粗提的乳酸菌细菌素与的牛血清白蛋白比 较只是初步的判定细菌素的存在,试验所提细菌素 分子质量的大小以及生物学的性能有待进一步研 究。 [ 参 考 文 献 ] [1] 凌代文,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法 [M].北京: 中国轻工业出版社,1999. [2] 李涤生,姚生.厌氧菌[M].合肥:科学技术出版社,1983. [3] 郭尧君.蛋白质电泳实验技术 [M].北京:科学出版社,1999. [4] 杨洁彬.乳酸菌———生物学基础及应用 [M].北京:中国轻工业 出版社,1996. 1 2 3 1 2 3 图2 X1、C15的电泳图谱 考玛斯亮兰染色 银染色 Abstract:Anbacteriostaticexperimentof10LABisolatedfromsilagewasconducted.TheresultsshowedthatLABnotonly couldinhibittheGram-positivebacteria,butalsoinhibittheGram-negativebacteriaobviously.X1,LM1andC15of10LABhadbet- terinhibitingeffectsthanothers.X1andC15wereselectedtoextractthebacteriocinandprovedtheirexistencewithSDS-PAGE. Keywords:lacticacidbacteria;bacteriostaticinvitro;bacteriocin BacteriostaticExperimentonLacticAcidBacteria ofSilageinVitroandBacteriocinExtraction WANGWeimiao,PANLing,ZHOUJie,QIKezong (CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,PRC) 试验研究 -3- 饲料博览 2006年第4期