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园 艺 学 报 2007，34 Acta Horticuhurae Sinica 白菜组织细胞微管间接免疫荧光检测体 张静宜，侯喜林 ，史公军，王利英 (南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095) 系的 优化 摘 要 ：利用正交试验设计，从酶浓度 、酶解时间、一抗稀释度、二抗稀释度 4种 因素 3个水平对白 菜组织细胞微管的间接免疫荧光检测体系进行了优化 ，确立了适合白菜组织细胞的微管免疫荧光检测体系 — — 果胶酶和纤维素酶浓度均为 1．0％，酶解时间 1 h；一抗稀释浓度 1：100，孵育时间 1 h；二抗稀释浓度 1：500，孵育时间 1 h。使用优化后的微管免疫荧光检测体系在荧光显微镜上能够快速观察到白菜组织细胞 内的微管。 关键词 ：白菜；正交试验；微管；间接免疫荧光 中图分类号：S 634．3 文献标识码：A 文章编号：0513．353X(2007)06．1551-04 Optimal Detection System of Immunofluorescence Labeling for Cell Microtu- bules in Brassica campestris ssp．chinensis ZHANG Jing—yi，HOU Xi—lin ，SHI Gong—inn，and WANG Li—ying (National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，Nanfing Agricultural University，Nanjing 210095，Chi- na) Abstract：In this study orthogonal design was used to optimize the system of immunofluorescence labe— ling for microtubules in Brassica campestris ssp．chinensis in four factors(enzyme concentration，digesting time，dilution of antibody I，dilution of antibody II)at three levels respectively．A suitable detection system of immunofluorescence labeling for cell microtubules was established：enzyme(pectinase and cellulose)con— centration was 1．0％ ，digesting time was 1 h；antibody 1 was diluted 1：100 for 1 h；antibody I1 was diluted 1：500 for 1 h．The microtubules could be observed effectively in Brassica campestris ssp．chinensis with this system． Key words：Brassica campestris ssp．chinensis；Orthogonal design；Mictotubule；Immunofluorescence labeling 微管是细胞骨架的主要成分之一，它和微丝、中间纤维靠众多的连接蛋白相互连接形成紧密的三 维网架结构，把细胞质中的细胞器和各种膜结构组织起来，在细胞形态、细胞分裂、物质运输、能量 转换及信息传递等方面起着重要的作用。因此，建立微管检测对研究白菜组织细胞的生长、发育 以及凋亡均具有重要意义。 间接免疫荧光法是利用抗原与一抗特异结合后，再用荧光素标记的二抗与一抗结合，荧光素受激 发光照射后产生荧光，通过荧光信号间接进行抗原检测的技术。间接免疫荧光法的特异性和灵敏度均 较高，已广泛用于生物大分子或结构的定位和形态显示。利用间接免疫荧光法定位微管，在动物上研 究较多，在植物上的研究大都集中在水稻 (Zhu et a1．，2002)、小麦 (刘刚和王东梅，2005)等作物 收稿 日期：2007-07—11；修回日期：2007—09—29 基金项目：江苏省高技术研究项目 (BG2004311) }通讯作者 Author for correspondence(E-mail：hxl@njau．edu．ca) 维普资讯 http://www.cqvip.com 园 艺 学 报 34卷 上，在朱顶红 (蔡雪和魏令波，1996)和一些百合科观赏植物 (Del Casino et a1．，1999)上也有报 道，但在蔬菜作物上还少有报道。 1 材料与方法 1．1 材料 供试材料为白菜品种 ‘暑绿’(侯喜林 等，2004)，由南京农业大学园艺学院白菜课组提供。 酶包括果胶酶和纤维素酶，微管标记抗体一抗为抗 0【一微管蛋白 IgG，二抗为 FITC结合的羊抗 鼠 IgG，均购自Sigma公司。 1．2 方法 方法参照Ye等 (2003)的报道并做改进。取白菜蕾期雄蕊，立即使用含1％DMSO和0．2％Tri— tonX一100的PEMS缓冲液 (含50 mol／L Pipes，5 mol／L EGTA，2 mol／L MgSO4，1．25％ 一1．5％蔗糖， pH 6．9)稳定 30-45 min。用含4％多聚甲醛、1％DMSO和0．2％ Triton X一100的PEMS缓冲液固定 45～60 min。PEMS缓冲液洗涤3次，每次 10 min。破碎材料，用PEMS缓冲液配制果胶酶和纤维素 酶 (Sigma)，37~C酶解。PEMS缓冲液洗涤 3次，再用 PBS(pH 7．0)冲洗 1次。加入 PBS稀释的一 抗 (anti一0【一tubulin IgG，Sigma，％9026)，37~C孵育 1 h。PBS缓冲液洗涤 3次，每次 10 min。加入 PBS缓冲液稀释的 FITC结合的二抗 (anti—mouse FITC conjugated，Sigma，F-0257)，37~C孵育 1 h。 PBS缓冲液洗涤5次，每次 10 min。50％甘油封固，制片。ZEISS Axioskop 40荧光显微镜观察并拍 照。 1．3 正交试验设计 根据果胶酶和纤维素酶浓度、酶解时间、一抗稀释浓度、二抗稀释浓度 4种因素，选用 (3 ) 正交设计 ( 1)。共 9个处理，每个处理2次重复，共 18个样品。 表1 免疫荧光各因素正交试验表 Table 1 Orthoronal design for m unofluorescence labeling 2 结果与分析 细胞壁是植物阻挡抗体进入的主要屏障。抗体到达不了细胞内部就无法与抗原 (微管)结合， 不会产生荧光信号，从而检测不到微管。酶的作用是适当破坏细胞壁使抗体顺利进入，所以，酶的浓 度与酶解时间对间接免疫荧光反应来说非常重要。 本试验发现处理 1、处理2和处理3，即果胶酶和纤维素酶浓度均为0．5％的时候，无论酶解时间 多长，均未见荧光表达，说明酶浓度太低对白菜的组织细胞壁起不到破坏作用，抗体无法进入细胞与 微管结合。而当果胶酶和纤维素酶浓度均为 1．5％的时候 (处理 7、处理 8和处理 9)，无论酶解时间 维普资讯 http://www.cqvip.com 6期 张静宜等：白菜组织细胞微管间接免疫荧光检测体系的优化 多长，荧光显微镜下也观察不到丝状微管，其中处理7完全未见荧光表达，处理8中可以看到模糊的 细胞轮廓 (图版，1)，但细胞已变形。处理9中观察到了大量的细胞碎片和抗体的块状聚集 (图版， 2)。说明1．5％的酶浓度太高，对细胞破坏严重，使部分微管解聚或流失无法保持其原有形状。最终 根据试验得出，果胶酶和纤维素酶的浓度均为1．0％对白菜的组织细胞壁来说最为恰当，酶解时间长 短对它影响并不是很明显。 不同的一抗、二抗一般都有其工作时的最佳稀释浓度，但不同材料对同一种抗体的要求也不完全 一 致。一抗、二抗若浓度太低，被标记的抗原亮度就低，微管不清晰；浓度太高则会产生过多的非特 异性结合，使背景信号加强，产生荧光信号与背景信号的矛盾，甚至在显微镜下能看到微管的同时还 能看到块状的荧光聚集。 本试验由于酶浓度的影响，无论一抗和二抗稀释浓度为多少，处理 1、2、3、7、8、9的所有材 料都观察不到微管。可观察到微管的4、5、6这 3个处理中，被染色的细胞明显增多，强度增强，为 绿色荧光，其中微管表达较强，呈亮绿色。处理 4的两个材料在显微镜下都观察到了清晰的微管组 织，它们在细胞内呈丝状排列 (图版，3、4)。处理 5中也看到了清晰的微管，呈网状，染色较深 (图版，5)，但背景荧光太强并有少量抗体的块状聚集 (图版，6)，说明一抗 、二抗浓度过高产生了 非特异性结合。处理6中也能看到丝状微管，但染色较淡，微管不清晰 (图版，7、8)，可能是因为 一 抗浓度过低没有与微管紧密结合。 由此可见，间接免疫荧光检测微管的结果受到多种因素的综合影响，根据在荧光显微镜下观察到 的结果及经济实用性的原则，确定 4号处理，即果胶酶和纤维素酶浓度均为 1．0％，酶解时间 1 h； 一 抗稀释浓度 1：100，孵育时间 1 h；二抗稀释浓度 1：500，孵育时间 1 h最佳。 本研究利用正交试验设计，从4种因素3个水平对白菜组织细胞微管的间接免疫荧光检测体系进 行优化，同时本着既准确又经济的原则，确立了适合白菜组织细胞的微管免疫荧光检测体系。采用优 化后的体系在荧光显微镜上能够快速有效地观察到白菜组织细胞内的微管，提高了检测的灵敏度，并 为进一步研究微管骨架在白菜雄性不育及自交不亲和中的作用提供了依据。 References Cai Xue，Wei Ling—bo．1996．Ultrastructural changes of microtubules in generative cell ofAmaryllis pollen during its germination．Journal of Basic Science and Engineering，4 (3)：330—334．(in Chinese) 蔡 雪，魏令波．1996．朱顶红成熟花粉萌发过程中生殖细胞微管变化的超微结构观察．应用基础与工程科学学报，4(3)：330 — 334． Del Casino C，Bohdanowicz J，Lewandowska B，Cresti M．1999．The organization of microtubules during generative·cell division in Convallaria majalis．Protoplasma．207：147—153． Hou Xi—lin，Cao Shou—chun，Zhang Shu—ning，Zhang Zeng—cui，Wang Jian-jun，Sun Hong·xia．2004．A new high—quality non·heading Chinese cabb variety‘Shu La’．Acta Horticulturae Sinica，3l(3)：421．(in Chinese) 侯喜林，曹寿椿，张蜀宁，张增翠，王建军，孙红霞．2004．优质白菜新品种 ‘暑绿’．园艺学报，3l(3)：421． Liu Gang，Wang Dong—mei．2005．Relationship of microtubule and[ca ] t in wheat mesophyll protoplast．Acta Biologiae Experimentalis Sini· 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