如何运用流式细胞仪进行T淋巴细胞亚群分析

如何运用流式细胞仪进行 T淋巴细胞亚群 流式细胞技术(FCM)是 70 年代发展起来得一种快速对单细胞定量分析的新技术,它 借鉴了荧光显微镜技术,同时利用与荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发 展,将荧光显微镜的激发光源改为激光,使之具有更好的单色性与激发效率,因而大大提 高了检测灵敏度,同时将固定的标本台改为流动的单细胞悬液,用计算机进行数据处理, 因而大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数, 为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段.目前,该技术已 经广泛用于基础研究与临床应用,在免疫学,遗传学,血液学,肿瘤学等领域内发挥前重 要的作用.本文着重介绍流式细胞仪基本原理及其在临床上的应用. 基本原理： 流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激 光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用 来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工 具。其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞面分子的荧光标记 单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体 停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群 混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过 FACS 的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制 成以单细胞排列的微细流束。当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧 光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细 胞表面发出的荧光。根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状 态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗 体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。 在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷 以特定准确的时间通过 FACS 的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打 碎成只含一个细胞的微滴。含有电荷的微滴就会从主液体流中偏移，穿过一双极板。带 正电荷的微滴被吸引至阴极，而带负电荷的被吸引至阳极。以这种方式，特定的细胞亚 1 群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷，从而将目的细胞从混合的细胞群中分 拣出来。 流式细胞仪的主要结构可以大致分为这样几个组成部分:激光系统,流式系统,信号 处理及放大,计算机系统.图一,图二概括了流式细胞仪的基本原理,当待测标本被制备 成单细胞悬液,经染色后进入流动室,流动室内充满流动的鞘液,鞘液压力与样品流压力 是不同的,当二者的压力差异达到一定程度时,鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐 个经过激光聚焦区.如果我们将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料,那么这些 染料将在细胞通过激光检测区时受激发出特定波长的荧光,通过一些波长选择通透性的 滤色片,我们可以将不同波长的散射光,荧光信号区分开来,并送到不同的光电配增管中, 经过 换,放大,数字化处理,我们就可以在计算机上直观地统计染上各种荧 光染 胞仪 还可 一系列信号转 料的细胞各自的百分率.选择不同的单克隆抗体及荧光染料,我们可以利用流式细 同时测定一个细胞上的多个不同的特征,如果对具有某种特征的细胞有兴趣,我们 以利用流式的分选功能将其分选出来,以便于进一步培养研究。 侧向及荧光信 前向散射光 Injector 鞘液 2 实验应用 流式细胞仪主要有两个最基本的用途：第一是可以定量分析鉴定活细胞表面表达的 特异分子，第二是进行特定的活细胞群的分离和纯化。 1. 免疫细胞群的分类 静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分，都是以致密的 核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。然而，这些细胞确是由功能各异的不同细 胞亚群所组成，各种细胞群表达各自特殊的表面分子。例如,B 淋巴细胞上表达有特异 的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的 T淋巴细胞表面表达特异的 CD3 分子。T淋巴细 胞又可进一步按其表达的不同表面标志细分成不同的亚群，如 CD4+CD8-和 CD4-CD8+亚 群。因此，可由这些特征性的表面标志，将细胞分为不同的群或亚群。 2. 免疫细胞的分化发育 免疫细胞分化发育的不同阶段，其表面标志也在不断地 发生着变化。如胸腺细胞（发育过程中的 T淋巴细胞），在发育的不同阶段从不成熟到 成熟，其表面标志经历了从双阴性（CD4-CD8-）到双阳性（CD4-CD8-），直到单阳性 （CD4+CD8-或 CD4-CD8+）的过程。正常生理状态下，发育不同阶段的胸腺细胞以一定 的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志，即可判定某些因素（基因突变等）对胸腺细 胞发育的影响。 3. 免疫细胞的分子表达 免疫细胞的不同因素的影响下，其表达的分子也会发生 变化。通过检测这些分子的变化，可分析细胞功能以及细胞分化状态等。例如，静止的 T淋巴细胞不表达或低水平表达 CD69 分子；而一经活化，其表达 CD69 分子数量明显增 加。因此，可通过检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态 的因素。 4. 免疫细胞的分离 如前所述，免疫细胞是一组极不均一的群体。所以在研究免 疫细胞功能时，常常需要把某些特异的细胞分离和纯化。虽然免疫细胞分离的很多， 但用 FACS 来纯化特定的细胞群是目前最为有效和方便的手段。例如，最近颇受关注的 CD4+CD25+T 淋巴细胞是一群具有免疫调节（免疫抑制）功能的细胞群。在对其特点及 功能进行研究时，首要的问题是分离该细胞群。用相应的单克隆抗体与其结合，再用 FACS 进行分离，就能得到纯度很高 CD4+CD25+T 淋巴细胞细胞群。而其他分离方法不仅 分离过程烦琐，也很难控制无菌条件及保证细胞纯度。 流式细胞仪在免疫学中的应用 1. 淋巴细胞亚群分析 3 淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群,在免疫应答过程中,未梢血 淋巴细胞发育成为功能不同的亚群.各亚群的数量和功能产生异常时,就能导致机体免 疫紊乱并产生病理变化.FCM 可以同时检测一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原,将不同 的淋巴细胞亚群数量的测定来监控病人的免疫状态,指导治疗. 2. 感染及其治疗效果观察 由于 T淋巴细胞在人体免疫系统中承担着重要的功能,因此,当感染发生时,T 淋巴 细胞各亚群的变化往往能很敏感地反映感染的状态与程度.例如,细胞膜外 CD4 分子有 HIV 识别部位,因此 CD4 细胞是 HIV 病毒受体,AIDS 病人 CD4+T 细胞明显减少,该指标是 诊断 AIDS 的重要标志.当病毒感染发生时(如乙型肝炎,EB 病毒和巨细胞包涵体病 毒),CD8+T细胞增多,对CD8细胞的测定有助于对感染的诊断,治疗效果的动态观察. 利 用流式细胞仪可对器官或骨髓移植后病人进行监控.当病人 CD3+,CD25+持续增加提示 已经开始发生排异,CD4/CD8持续下降表明有感染发生,当其比值小于0.2时必须停用免 疫抑制剂. 由于流式细胞仪将静态的,显微镜下肉眼观察改为动态的,计算机信号处理, 因此,在流式细胞仪上 T细胞亚群统计方式已从传统的荧光显微镜下计数 200 个细胞成 为几秒钟内计数上万个,因此结果更真实,更具有统计意义. 3. 其他免疫功能性疾病分析 流式细胞仪便捷,准确的特点可以用来对自身免疫性疾病进行检测与疗效观察. SLE 病人的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况和器官侵犯程度.活动或非活动性 SLE 伴有多系统疾病但无肾脏损害的病人可出现 CD4/CD8 比值升高,伴有严重肾脏损害 的 SLE 病人可出现低 CD4+,高 CD8+的现象. 有证据表明外周血 HLAB27 的表达及其表达 程度与强直性脊髓炎的发生有很大程度的相关性,利用流式细胞仪可以进行 HLA-B27./HLA-B7 双标记来检测 HLA-B27 阳性细胞,同时排除交叉反应.另外,CD23 表达 的增加与变态反应性疾病,自身免疫性疾病,肾病综合症有关,而且阳性率与病情严重程 度呈正相关,治疗有效后 CD23+细胞减少. 利用流式细胞仪检测 PNH 血细胞的细胞膜所 缺乏的糖化肌醇磷脂(GPI)锚连接的蛋白如 DAF(CD55.)与 MIRI(CD59..)来确诊阵发性 睡眠性血红蛋白尿传统的血清溶血试验具有更高的特异性与灵敏度. 分析程序 流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。第一，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细 胞制备、细胞的荧光染色；第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；第三，是结 4 果分析阶段。 操作步骤 1、单细胞悬液的制备：将 1×105~1×107的细胞放入 1.5ml离心管中 3000r/min离心 5 分钟，弃上清；加入FACS缓冲液 100μl悬浮细胞。 2、封闭表面 Fc 受体：在步骤 1中加入 Fc 受体抗体 0.5μl（0.5mg/ml），水浴 3分钟。 3、细胞与荧光抗体结合：在步骤 2中加入荧光抗体 1μl（0.5mg/ml），水浴 30 分钟。 4、洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤 3中加入 FACS 缓冲液 350μl，轻轻混匀， 3000r/min，离心 5分钟，弃上清，重复步骤（4）2次。 5、上样前处理：取 100μl 仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬 浮细胞，将细胞悬液移入 FACS 专用管中，准备进行仪器检测和分析。 仪器的操作 以 FACSCaliburTM(BD Biosciences)仪器为例。仪器主要分为主机部分（包括激 光激活源，射流，射线探测器）和计算机部分（CELLQuest softwere）。仪器的操作分 为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。 1.使用前的准备 （1）打开电源：包括系统电源和主机部分电源。 （2）检查供液槽和废液槽：供液槽应含足够的仪器缓冲液，废液槽应在上次使用 后清洗干净。 （3）使机器处于负亚状态，才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。 （4）机器处于可应用状态时，指示灯会变成绿色。 2.使用中的操作 （1） 计算机部分——使用 CELLQuest 程序系统软件： 设定所要检测细胞的数量：一般设 10 000~20 000 个细胞。 命名本次实验：一般含使用者的姓名和实验日期。 打开记数部分：显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。 将微机与主机连接：控制检测时的预检测和实际检测。 主机设定：一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件，包括探测器的电压。探 测器的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。 选择检测的波长和表达方式（plot）：如果用一种荧光抗体，一般选直方图 5 （histogram）(表 11-1)：如果用两种荧光抗体，常选点状二维图（dot plot）或轮廓 线图（contour plot）表 CD69 分子表达检测直方图的数值说明 a.anti-CD3(-)检测结果 mar ker Left, right ev ents %ga ted %to tal mean Geo, mean CV med ian P eak Ch All 1,991 0 10 000 100 .00 100 .00 12.0 6 4.59 1453. 37 3.2 2 1 M1 1,105 99 69 99. 69 99. 69 8.04 4.53 134.4 1 3.2 2 1 M2 105,9 910 31 0.3 1 0.3 1 1304 .57 309. 78 223.1 3 164 .00 1 12 b.abti-CD3(2ng/ml)检测结果 marke r Left,righ t events %gated %total mean Geo,mean CV median Peak Ch All 1,9910 10000 100.00 100.00 200.53 48.90 193.6 8 61.53 1 M1 1,100 5776 57.76 57.76 24.41 11.69 109.2 2 12.86 1 M2 100,9910 4237 42.37 42.37 440.31 344.57 114.76 361.90 417 c.abti-CD3(10ng/ml)检测结果 marker Left,right events %gated %total mean Geo,mean CV median Peak Ch All 1,9910 10000 100.00 100.00 236.90 74.05 155.88 113.42 495 M1 1,90 4602 46.02 46.02 25.13 12.83 101.67 14.42 1 M2 90,9910 5425 54.25 54.25 415.81 327.83 102.28 349.12 495 6 CD4 及 CD8 细胞点状二维图结果 quad events %gated %total Xmean Xgeo.mean Ymean Ygeo.mean UL 1614 16.14 16.14 3.68 2.99 346.86 291.03 UR 7425 74.25 74.25 99.38 76.39 308.36 256.26 LL 558 5.58 5.58 4.00 3.39 9.91 6.88 LR 403 4.03 4.03 123.32 93.65 7.14 4.35 不同的荧光物要求选择不同的激发波长，参见下表 用于 FACS 的荧光物 荧光物 激发波长（nm） FITC 525(green) PE 575(orabge-red) RED613 610(red) PI 620(red) PerCP 650(red) TRI-COLOR 650(red) CyChrome 670(red) (2)细胞的吸入：将装有细胞的 FACS 测定管放置到机器吸管孔处。 先预检测样品，然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度（低、中或 高）。所有的数据将自动存入微机。 应用举例 (一)小鼠胸腺细胞 CD4 及 CD8 分子表达的检测 a .简要说明 (1)细胞为小鼠胸腺细胞。 (2)抗体为 PE 标记的抗 CD4 抗体和 FITC 标记的抗 CD8 抗体。 b.结果 以点状二维图（ dot plot）表示，见表 11-2。横坐标为 CD8 分子，纵坐 标为CD4分子。所以右上代表双阳性细胞群，左下代表双阴性细胞群，左上代表CD4+CD8- 的单阳性细胞群，右下代表 CD4-CD8+单阳性细胞群。 7 c.结果分析 胸腺中存在着发育不同阶段的胸腺细胞，这些发育不同阶段的胸腺细 胞表达 CD4 及 CD8 分子存在着差异。上面的结果是正常小鼠胸腺细胞 CD4 及 CD8 分子的 表达情况：①存在着 4种亚群：CD4-CD8-的双阴性细胞群（5.6%），CD4+CD8+的双阳性 细胞群（74.3%），CD4+CD8-的单阳性细胞群（16.1%）和 CD4-CD8+的单阳性细胞群（4.0%）； ②在这 4种亚群中以 CD4+CD8+的双阳性细胞群为主（75%）。 (二)小鼠脾细胞中 T细胞和 B细胞的组成 1. 简要说明 （1） 细胞为小鼠脾细胞 （2） 抗体为 PE 标记的抗 CD3 抗体和 FITC 标记的抗 CD45R 抗体 2. 结果 以点状二维图表示，见表 11-4。横坐标为 B220 分子，纵坐标为 CD3 分 子。因此，左上为 T细胞群，右下为 B细胞群。 3. 结果分析 在脾脏中主要存在有两大类淋巴细胞群——T细胞和 B细胞。其中 B 细胞占 60%左右，T细胞占 30%。 B220 及 CD3 细胞点状二维图结果 quad events %gated %total Xmean Xgeo.mean Ymean Ygeo.mean UL 3067 30.67 30.67 2.36 2.08 87.39 50.96 UR 371 3.71 3.71 183.95 86.41 1888.23 141.27 LL 619 6.19 6.19 3.77 3.23 3.82 3.07 LR 5943 59.43 59.43 215.54 186.49 1.91 1.60 (三)活化 T细胞 CD69 分子的表达 1.简要说明 （1） 成熟 T细胞来自正常小鼠脾脏，经纯化而获得，通常情况下 T细胞处于静 止状态，而在不同浓度的抗 CD3 抗体的刺激下 T细胞活化。 （2） 抗体为 FITC 标记的抗 CD69 抗体。 2. 结果 以直方图表示，参见表 11-1。横坐标为荧光的强度，纵坐标为具有相 应荧光强度的细胞数。 3. 结果分析 在没有抗 CD3 抗体刺激时，绝大多数处于静止状态的 T细胞不表达 CD69 分子（CD69+0.3%）；在 2μg/ml 抗 CD3 抗体刺激下，42.4%的 T 细胞表达 CD69 分 8 子；在 10μg/ml 抗 CD3 抗体刺激下，54.3%的 T 细胞表达 CD69 分子。说明静止的 T细 胞不表达或表达较少的 CD69 分子，而活化的 T细胞则表达高水平的 CD69 分子，并且该 分子的表达随着活化的强度而增加。因此，检测 CD69 分子可作为 T细胞活化的标志。 9