栓剂申报资料-21

4栓 资料项目21 注册分类：化学药品6 资料项目21 4栓 第三部分：药理毒理研究资料 局部（粘膜）刺激性、皮肤 过敏性试验资料和文献资料 研究机构名称： 地 址： 电 话： 主要研究者姓名： 试验者姓名： 试验起止日期： 原始资料的保存地点： 地 址： 联系人： 电 话： 申请机构名称： 资料项目24 局部刺激性、皮肤过敏性试验资料及文献资料 4栓局部刺激性试验资料 【摘要】 4栓按25、50 mg•kg-1剂量连续直肠给药3天，给药期间及末次给药后24 h、48 h及7 d内，实验大鼠一般状况（食欲、精神、二便等）良好，未发生全身系统反应甚至死亡情况；各组大鼠肛门局部未见异常分泌物，直肠粘膜未见充血、红肿、溃疡、糜烂等刺激反应。组织病理学检查结果显示，4栓高、低剂量组（25 mg•kg-1及50 mg•kg-1）、基质对照组和正常对照组多次给药后，直肠粘膜结构和细胞形态均未见异常改变，直肠粘膜未见损伤性变化及大量炎细胞浸润，表明4栓直肠给药无明显刺激毒性。 4栓系以“4栓”（国家食品药品监督管理局国家药品标准收载，标准编号为，*有限公司生产，现有50 mg和100 mg两种规格，批准文号分别为：国药准字H10930049和H10930050）仿制而成，具解热镇痛之功效。目前，4栓是非常适于儿童使用的解热镇痛药物之一，临床上主要用于由感冒、急性上呼吸道感染、急性咽喉炎等疾病引起的小儿发热。该剂型结合栓剂的诸多优点，如：质量稳定、局部作用时间长、生物利用度高、工艺简单等；能够最大限度克服原口服片剂中存在儿童拒绝服用、具有无效摄入量、生物利用度低、时有恶心或呕吐、影响服用及胃肠道不良反应等缺点；更好地符合现代化学药物新制剂“三小”、“三效”的基本原则。 9系列制剂临床使用疗效确切，质量稳定；4栓的临床用量为每次1粒，每日2～4次，3日为一疗程，相当于布洛芬给药量为100～200 mg/日（50 mg/粒）、200～400 mg/日（100 mg/粒），直肠给药；即每日临床最大给药剂量分别为200 mg/60kg（50 mg/粒）、400 mg/60kg（100 mg/粒），即3.33～6.67 mg•kg-1。为了保证4栓剂的安全、有效、质量可控，按照国家食品药品监督管理局颁布实施的《药品注册》中有关化学药品注册分类第6类的项目要求，仿制4栓，主要针对治疗由感冒、急性上呼吸道感染、急性咽喉炎等疾病引起的小儿发热。 按照《药品注册管理办法》分类，4栓属于“己有国家药品标准的制剂”。根据《药品注册管理办法》对化学药品注册分类第6类的要求，参照化学药物研究指导原则，通过试验研究对其局部刺激性进行了深入评价，以期为其临床应用提供安全性参考。 本实验主要考察4栓直肠给药后是否引起粘膜等发生红肿、充血、渗出、变性或坏死的局部反应，客观评价其可能存在的毒性，重点考察对于直肠粘膜是否存在刺激性[1~5]。 一、试验目的 观察4栓在3 d给药周期内多次直肠给药后所引起的局部粘膜刺激反应（红肿、充血、渗出、变性或坏死等）及其严重程度，以评价药物可能存在的毒性。 二、动物及仪器 1、动物 普通级SD大白鼠，40只，雌雄各半，雌性健康未孕，体重220～240g，动物合格证书：SCXK(鄂)2004-0007号，由实验动物中心提供。 2、 仪器 LD型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司） 三、受试物及其配制 1、供试药物：4栓（，批号为050901），规格分别为50 mg•粒-1及100 mg•粒-1。系以*粉碎成细粉，以吐温-80助溶，加入36型混合脂肪酸甘油酯，加热熔化，搅匀，冷却，制成栓剂。 2、空白基质：除不含主药外，按处方比例加入吐温-80，以36型混合脂肪酸甘油酯直接加热熔化，搅匀，冷却，制成栓剂。 四、方法 1、给药途径及其剂量： 药物组取浓度分别为50 mg•粒-1、100 mg•粒-1的4栓，直肠给药，与临床给药途径一致。给药剂量为0.14 g栓剂•只-1，给药剂量分别为25 mg•kg-1、50 mg•kg-1，按公斤体重计算相当于每日临床剂量的7.5倍；按动物系数折算相当于每日临床剂量的1.3倍。基质对照组给药方法、给药容积同药物组，正常对照组不作任何处理。 2、 实验分组： 将动物随机分成4组，分设药物高、低剂量组、基质对照组和正常对照组，每组10只动物。 3、 给药方法： 取SD大白鼠40只，雌性，体重(230±10)g，适应性饲养2 d。药物组以4栓直肠给药，给药时两人合作，一人以左手食指和拇指抓住大鼠头颈部，翻转大鼠身体于左手掌中固定，使动物呈仰卧位、下腹部朝上（必要时直接将动物仰卧位固定于操作台上）；另一人手着一次性橡胶手套，将0.14 g药栓缓缓塞入大鼠肛门内，深度约2 cm；若遇动物抵抗性强或药栓渗漏，可给予数分钟的间隔时间，使其性情缓和，肛门口微张，再行给药，必要时可用油纸、纱布覆盖，并以医用胶布固定，以保证药栓与直肠粘膜接触达到有效时间；基质对照组同法给予同体积空白基质，正常对照组不作任何处理，照常饲养。 每天给药1次，连续3 d。末次给药24 h后，药物高、低剂量组组、基质对照组、正常对照组分别处死6只动物，取出直肠粘膜组织，以10％甲醛固定、石蜡包埋切片、HE染色，光镜观察组织病理学变化。其余动物分别观察至停药后48 h（各组均为2只动物）、停药后7 d（各组均为2只动物），按观察指标即刻及逐日考察动物全身状况、局部刺激症状及直肠粘膜的变化。 4、 观察指标： (1) 一般观察： 观察动物给药期间及末次给药24 h后的一般状态（食欲、精神、二便等）、行为活动、外观体征以及是否出现直肠充血、红肿、溃疡、糜烂等局部刺激反应，尤其应注意肉眼观察给药后直肠粘膜的变化情况，包括药栓在局部吸收后的全身反应。记录所有动物的死亡情况、中毒症状及中毒反应的起始时间、严重程度、持续时间等。局部反应以计分方式表示，包括红斑、水肿、充血程度及范围等，参见表1。 表1 局部粘膜刺激反应分级标准[6] 局部粘膜刺激反应 分级评分 直肠粘膜表面完整，无明显改变 0 直肠粘膜轻度充血，有少量分泌物 1 直肠粘膜中度充血，分泌物较多 2 直肠粘膜重度瘀血，水肿，炎性分泌物很多，粘膜变性、坏死 3 (2) 组织病理学检查： 详细叙述给药后24 h、48 h、7 d内，各时间段动物直肠粘膜的组织病理学变化。 (3) 可逆性观察： 进行停药后恢复期的观察，以明确毒性反应的恢复情况。 五、结果 1、一般情况观察： 连续3天直肠给予4栓（0.48 g•kg-1），末次给药24 h、48 h及7 d后，各组大鼠外观体征正常，行为如常，饮食、二便、毛色等未见异常，未发生全身系统反应甚至死亡情况。给药期间及末次给药后各组大鼠肛门局部无异常分泌物，直肠粘膜表面结构完整，可见明显褶皱，未见充血、红肿、溃疡、糜烂等局部刺激反应。动物局部粘膜刺激反应评分结果见表2。 表2 各组大鼠直肠粘膜刺激反应评分结果 时间 组别 直肠给药后24h 直肠给药后48h 直肠给药后7d 0 1 2 3 平均分 0 1 2 3 平均分 0 1 2 3 平均分 基质对照组 10 0 0 0 0 6 0 0 0 0 3 0 0 0 0 药物组 15 0 0 0 0 9 0 0 0 0 4 0 0 0 0 正常对照组 5 0 0 0 0 3 0 0 0 0 2 0 0 0 0 2、 组织病理学检查： 正常对照组大鼠直肠粘膜上皮结构清楚、无缺损、无变性坏死、无增生、间质无炎性细胞浸润。直肠壁结构正常，由粘膜层、粘膜固有层、肌层、及浆膜组成；粘膜上皮结构完整，被覆单层柱状上皮，排列成直管状，上皮细胞间夹有大量杯状细胞，粘膜固有层内未见淋巴细胞浸润及小血管充盈。 与正常对照组比较，基质对照组与药物组可见少数动物直肠粘膜上皮部分区域上皮细胞脱失，但不伴或仅见少数散落的炎细胞浸润；粘膜固有层内见小血管轻度充盈，偶见少量淋巴细胞浸润，未见损伤性变化及大量炎细胞浸润。药物组与基质对照组比较在数量及程度上均无显著性差异（P>0.05），考虑主要与直肠给药的机械性刺激有关，仅为异物刺激直肠粘膜的一种防卫性反应。详细结果见表3，有关组织病理学照片参见附图1－5。 表3 各组大鼠局部粘膜刺激反应组织病理学检查结果 时间段 正常对照组 药物组（25 mg•kg-1） 药物组（50 mg•kg-1） 基质对照组 给药后24h 各大鼠直肠粘膜上皮结构完整；直肠粘膜固有层均未见淋巴细胞浸润及小血管轻度充盈 （n＝6） 1只大鼠直肠粘膜上皮部分区域上皮细胞脱失，间质内见局灶性炎细胞浸润；1只大鼠直肠粘膜固有层可见小血管轻度充盈及局灶性淋巴细胞，其余未见异常 （n＝6） 1只大鼠直肠粘膜上皮部分区域上皮细胞脱失，间质内见局灶性炎细胞浸润；2只大鼠直肠粘膜固有层可见小血管轻度充盈及局灶性淋巴细胞，其余未见异常 （n＝6） 1只大鼠直肠粘膜上皮部分区域上皮细胞脱失；1只大鼠直肠粘膜固有层可见小血管轻度充盈及局灶性淋巴细胞，其余未见异常 （n＝6） 给药后48h 各大鼠直肠粘膜上皮结构完整；直肠粘膜固有层均未见淋巴细胞浸润及小血管轻度充盈 （n＝2） 1只大鼠直肠粘膜上皮部分区域上皮细胞脱失，直肠粘膜固有层可见小血管轻度充盈及局灶性淋巴细胞，其余未见异常 （n＝2） 1只大鼠直肠粘膜上皮部分区域上皮细胞脱失，间质内见局灶性炎细胞浸润；1只大鼠直肠粘膜固有层可见小血管轻度充盈及局灶性淋巴细胞 （n＝2） 1只大鼠直肠粘膜被覆上皮完整，间质内可见炎细胞浸润，粘膜固有层可见小血管轻度充盈，其余未见异常 （n＝2） 给药后7d 各大鼠直肠粘膜上皮结构完整；粘膜固有层均未见淋巴细胞浸润及小血管轻度充盈 （n＝2） 各大鼠直肠粘膜上皮结构完整；粘膜固有层均未见淋巴细胞浸润及小血管轻度充盈 （n＝2） 各大鼠直肠粘膜上皮结构完整；粘膜固有层均未见淋巴细胞浸润及小血管轻度充盈 （n＝2） 各大鼠直肠粘膜上皮结构完整；粘膜固有层均未见淋巴细胞浸润及小血管轻度充盈 （n＝2） 六、结论 4栓按25、50 mg•kg-1剂量连续直肠给药3天，给药期间及末次给药后24 h、48 h及7 d内，实验大鼠一般状况（食欲、精神、二便等）良好，未发生全身系统反应甚至死亡情况；各组大鼠肛门局部未见异常分泌物，直肠粘膜未见充血、红肿、溃疡、糜烂等刺激反应。组织病理学检查结果显示，4栓组（25 mg•kg-1及50 mg•kg-1剂量组）、基质对照组和正常对照组多次给药后直肠组织结构和细胞形态均未见显著异常改变，各组大鼠直肠粘膜未见损伤性变化及大量炎细胞浸润，表明4栓直肠局部给药无明显刺激毒性。 参考文献： 1、 中华人民共和国卫生部药政管理局.新药研究指南[M].北京：人民卫生出版社，1993.213-215. 2、 国家食品药品监督管理局药品审评中心：药品技术审评论坛.药物研究技术指导原则（征求意见稿）——化学药物分册[M].2003.34-37. 3、 袁伯俊，王治乔.新药临床前安全性评价与实践[M].第1版.北京：军事医学科学出版社，1997.152. 4、 徐叔云，主编.药理实验方法学[M].第3版.北京：人民卫生出版社，2002.235-236. 5、 陈奇，主编.中药药理研究方法学[M].第1版.北京：人民卫生出版社，1993.164. 6、 王北婴，李仪奎.中药新药研制开发技术与方法[M].第1版.上海：上海科学技术出版社，2001.815. 附图1-5： 局部刺激性试验有关组织病理学照片 4栓皮肤过敏性试验资料 【摘要】 将40只白色豚鼠随机分成4组，每组10只，分别给予空白基质、4栓高、低剂量组及1% 2，4－二硝基氯代苯，涂抹于脱毛区域进行试验，并按皮肤过敏反应评分标准进行评分。试验及计算结果表明，无论按反应平均值或者按致敏率计算，基质对照组、药物组豚鼠在观察期间均未出现红斑或水肿，致敏率为0%；而阳性对照药2，4-二硝基氯代苯具有极度致敏性，其致敏率达100%。结果表明4栓对豚鼠皮肤不产生致敏性。 一、试验目的 观察不同规格（50 mg/粒及100 mg/粒）4栓皮肤外用给药后是否引起动物皮肤发生红斑、水肿等局部过敏反应，客观评价其可能存在的皮肤过敏毒性。 二、动物及仪器 1、动物 普通级白色豚鼠，40只，雌雄各半，体重240～260g，动物合格证书：SCXK(鄂)2004-0007号，由实验动物中心提供。 2、仪器 LD型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司） 三、受试物及其配制 1、供试药物：4栓（，批号为050901），规格分别为50 mg•粒-1及100 mg•粒-1。系以粉碎成细粉，以吐温-80助溶，加入36型混合脂肪酸甘油酯，加热熔化，搅匀，冷却，制成栓剂。 2、空白基质：除不含主药外，按处方比例加入吐温-80，以36型混合脂肪酸甘油酯直接加热熔化，搅匀，冷却，制成栓剂。 3、阳性致敏物：将2,4-二硝基氯苯以70％乙醇稀释成1%浓度作为致敏浓度，以70％乙醇稀释成0.1%浓度作为激发浓度。 4、脱毛剂：8%硫化钠水溶液。 四、方法 1、给药途径及其剂量： 药物组取浓度分别为50 mg•粒-1、100 mg•粒-1的4栓，加热熔化后皮肤外用给药，给药容积0.2 mL•只-1。空白基质、阳性致敏物的给药方法、给药容积同药物组。 2、 实验分组： 取供试用豚鼠40只，将豚鼠脊柱两侧毛发用弯剪刀剪去，注意不得剪破皮肤，每侧各约3×3 cm2，剩余的少量短毛再用8%硫化钠水溶液脱去，并用温水擦洗干净。次日，将动物随机分成4组，分设药物高、低剂量组，基质对照组和阳性对照组，每组10只，雌雄各半。 3、给药方法及观察指标： 给药方法：药物高剂量组给予4栓（100 mg/粒），药物低剂量组给予4栓（50 mg/粒），基质对照组给予空白基质，阳性对照组给予阳性致敏物，加热熔化后皮肤外用给药。 致敏接触：于各组动物左侧脱毛区域分别涂以4栓、空白基质、1% 2,4-二硝基氯苯各0.2 mL/只。给药后用一层油纸和两层纱布覆盖，再用医用胶布固定。给药6 h后，脱去覆盖物。于第7 d和第14 d，以同样方法各重复一次。 激发接触：于末次致敏接触后14 d，分别将4栓、空白基质和0.1% 2,4-二硝基氯苯0.2ml/只，分别涂于各组动物右侧脱毛区域。给药后按上述方法覆盖、固定，6 h后脱去覆盖物，用温水洗净残留药物。即刻观察，然后于24 h、48 h、72 h再次观察皮肤过敏反应情况，并按表4、表5标准进行评价，并计算反应平均值和致敏率 (致敏率以四次观察出现皮肤红斑或水肿动物例数最多的一次计算)。 红斑形成总分＋水肿形成总分 合计动物数 出现皮肤红斑或水肿的动物例数 受试动物总数 表4 皮肤过敏反应程度的评分标准 皮肤过敏反应情况 分值 红 斑 无红斑 0 轻度红斑，勉强可见 1 中度红斑，明显可见 2 重度红斑 3 紫红色红斑并有焦茄形成 4 水 肿 无水肿 0 轻度水肿，勉强可见 1 中度水肿，明显可见（边缘高出周围皮肤） 2 重度水肿，皮肤隆起1mm，轮廓清楚 3 严重水肿，皮肤隆起1mm以上并有扩大或水泡、破溃 4 总分值 8 表5 皮肤致敏性评价标准 致敏率(%) 反应强度 0～10 无致敏性 11～30 轻度致敏性 31～60 中度致敏性 61～80 高度致敏性 81～100 极度致敏性 五、结果 1、一般情况观察： 药物组给予4栓后，各组豚鼠外观体征正常，行为如常，呼吸状况未见异常，未见动物发生哮喘、站立不稳或休克等严重全身性过敏反应。 2、皮肤过敏反应情况评分结果： 阳性对照组10只豚鼠去除受试物后即刻观察，皮肤均出现不同程度的红斑或水肿现象，致敏率达100%，此后逐渐减轻。基质对照组、药物组豚鼠在观察期间均未出现红斑或水肿情况，致敏率为0%。各观察时间点的评分结果以及致敏率结果见表6。 表6 皮肤过敏反应平均分值及致敏率测定 组别 即刻 24 h 48 h 72 h 致敏率(%) 阳性对照组 3.1 2.1 1.7 1.3 100 对照组 0 0 0 0 0 药物组 0 0 0 0 0 六、结论 结果表明，4栓皮肤外用给药对实验豚鼠皮肤无致敏性。 图3 药物高剂量组直肠给药后24 h大鼠直肠粘膜组织形态（HE×200） 图4 药物低剂量组直肠给药后24 h大鼠直肠粘膜组织形态（HE×400） 图6 基质对照组、药物组直肠给药后7d大鼠直肠粘膜组织形态（HE×200） 图1 正常对照组直肠给药后大鼠直肠粘膜组织形态（HE×100） 图2 基质对照组直肠给药后24 h大鼠直肠粘膜组织形态（HE×400） 反应平均值 = 致敏率 = 图5 基质对照组、药物组直肠给药后48h大鼠直肠粘膜组织形态（HE×400） ×100％ 9