通讯作者 :梅建 (meijiansh @yahoo . com. cn)
·综述 ·
结核分枝杆菌中的分枝菌酸
孙丕 梅建
(上海市疾病预防控制中心 上海 200336)
肺结核是一种由结核分枝杆菌感染引起的呼吸
道传染病 ,比较容易在密集的人群中传播而导致公
共卫生问题。20 多年前肺结核已经得到了基本控
制 ,但是 ,近年来结核病发病率逐年上升 ,死灰复燃 ,
又成为全球范围内潜在的致病源 , 每年可以导致
200 万人死亡。由于无法提供充足的临床药物及不
正确的用药方式 ,出现了耐药性结核。近年来 ,艾滋
病患者合并结核菌感染更是引起了关注 ,因为艾滋
病病人本身脆弱的免疫系统致使他们很容易感染结
核菌 , 而且一旦感染会经常导致死亡。由于结核分
枝杆菌的生长、致病性、对药物的耐药性以及抗酸特
性都和细胞壁中所含有的分枝菌酸有关。本文从分
枝菌酸在细胞壁中的位置、分子结构的多样性、生物
合成的过程和抑制分枝菌酸的生物合成的药物异烟
肼及其在耐药方面的作用、检测方法等方面进行综
述 ,以期待对分枝菌酸有更深入的了解。
1 分枝菌酸在结核菌细胞壁中的位置
分枝菌酸是 Stodola 等人首次于 1938 年从结
核分枝杆菌中提取的不同于常规脂肪酸的 1 种大相
对分子量的疏水性的α2羟基脂肪酸。它区别于其
他菌类脂肪酸的特征性化学结构是具有一个碳数为
22~26 个的短臂和一个碳数为 50~60 个的长臂。
在结核分枝杆菌的细胞壁中 ,分枝菌酸和其中的一
种重要的多糖2阿拉伯半乳聚糖连接 ,阿拉伯半乳聚
糖通过磷脂键又连接在维持结核菌骨架结构并保持
它们的形状的肽聚糖上。分枝菌酸是通过其分子中
的羧基与阿拉伯半乳聚糖中的羟基通过酯键垂直连
接在阿拉伯半乳聚糖上 ,而结核菌壁外层的其他糖
脂和游离脂类则嵌在分枝菌酸之中[ 1 ] (图 1) 。这些
包含分枝菌酸在内的脂质成分构成了独特的细胞壁
结构 ,由于这层厚厚的疏水性渗透屏障相当紧密 ,从
而能够保护细菌不受外来有毒化学物质的侵害。在
这层保护层下 ,结核分枝杆菌能有效地避开宿主的
图 1 分枝菌酸在结核菌细胞壁中的位置
免疫系统 ,使其很容易在巨噬细胞中生长。这层保
护层中的分枝菌酸是结核菌镜检染色实验 Ziehl2
Neelsen 以及荧光染色实验中分别和石碳酸酚红及
金胺发生显色反应的唯一抗酸物质[2 ] 。同时不同结
构的分枝菌酸还和结核杆菌的毒力相关。
2 分枝菌酸结构的多样性及结构与毒力的
关系
分枝菌酸不仅存在于分枝杆菌属中 ,还存在于诺
卡菌属、红球菌属、棒状杆菌属中 ,是细胞壁中的主要
成分 ,占细胞干重的 40 %~60 % ,结核分枝杆菌的致
病性和它相应的细胞壁的结构与成分密切相关。
分枝菌酸的结构是通过 TL C、GC、HPL C 及
NMR 分析技术确定的。不同菌属的菌株中所含的
分枝菌酸的碳链的长度是不同的。在棒状杆菌
(Corynebacterium)中 ,碳链中碳原子的个数在 20~
38 之间 ;在诺卡菌 (Nocardia) 中碳链的长度在40~
60 之间。在结核分枝杆菌中 ,分枝菌酸的典型结构
为一个含有羧基和羟基官能团的 60~90 个碳长的
线性长链 ,其中 ,在羧基的α2位带着烷基侧链 ,α2位
为羟基 ,而羧基的α2位所带的侧链通常是含有 22~
24 个碳原子的烷基链。从终端为甲基的碳开始到
含有羟基的碳结束的这段碳链称为 meromycolic
链 ,而另一端则称为 mycocerosic 链。
在结核分枝杆菌中分枝菌酸主要有 3 类结构 ,
即α2分枝菌酸 ,酮 ( keto)2分枝菌酸和甲氧基 ( me2
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Ⅰ为α2分枝菌酸 ,它只有顺式结构。Ⅱa 与 Ⅱb 属于甲氧类型
的分枝菌酸 , Ⅱa 是顺式 , Ⅱb 是反式结构。Ⅲa 和 Ⅲb 属于酮基分枝菌酸 , Ⅲa 是顺式 , Ⅲb 是反式结构
图 2 Mtb 中分离出的分枝菌酸的化学结构
狋犺狅狓狔)分枝菌酸 (图 2) 。极性最小的α2分枝菌酸的
含量是最高的 ,而甲氧基和酮基类型的分枝菌酸相
对含量较少。在非结核分枝杆菌中还存在有其他结
构的分枝菌酸 ,如在 S1 smegmatis 耻垢分枝杆菌中 ,
就包含有α1、α’等类型 ,其结构的差异只是分子结
构中的环丙烷官能团被双键或环氧丙烷所替代。α’
型分枝菌酸 ,极性稍强 ,相对分子量较低 ,含 60~68
个碳 ,在 TL C 薄层上很容易与α2分枝菌酸分开[3 ] 。
α2分枝菌酸含有顺式的环丙烷张力环 ,另 2 种类型
的分枝菌酸则带有远离羧基端含氧的官能团。这些
氧化了的官能团包括酮基、甲氧基团 ,它们分别分为
顺式和反式结构。这些官能团中 ,双键、甲基和环丙
烷基属于非极性官能团 ,而酮基和甲氧基属于极性
官能团。这些官能团的不同极性可引起细胞壁的变
化 ,如在最远端的环丙烷官能团的存在可以提高结
核菌对外界氧化杀伤的耐受力 ,同时环丙基的存在
也限制了细胞壁的流动性[4 ] 。
酮基和甲氧基分枝菌酸的存在与否可以明显改
变细胞壁的渗透性能 ,渗透力的降低使得结核分枝
杆菌对生长过程中所使用的特殊的营养成分的利用
度发生改变 ,使得结核分枝杆菌的存活率降低 ,表现
为结核分枝杆菌的毒力减低。这些不同类型的分枝
菌酸通过不同的组合构成了具有不同毒力的菌群。
值得注意的是 ,分枝菌酸的单链上的一个微小的变
化 ,就可以引起结核杆菌毒力的变化 ,如分枝菌酸中
的环丙烷被双键替代 ,就会影响与海藻糖相联接的
索状结构的形成从而影响了其毒力。
3 分枝菌酸的生物合成、相关毒力基因及抑
制分枝菌酸的生物合成的药物异烟肼及
其耐药的产生
结核分枝杆菌的分枝菌酸的生物合成和其他微
生物如酵母真菌等中脂肪酸的生物合成过程既有相
似的地方也有其独特的地方。在过去多年研究中 ,
已经积累了大量的关于分枝菌酸是怎样被合成并组
装衍变成最后的产物的研究成果 ,其生物合成的途
径与机理也得到了验证[5 - 7 ] 。早在 1977 年 Bloch
和他的同事就证实了在分枝杆菌中存在着对其生物
合成起作用的 2 种类型的多功能酶混合体 ,即 Ⅰ型
和 Ⅱ型脂肪酸合成酶 ( FAS2Ⅰ, FAS2Ⅱ) 。一般认
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为 ,分枝菌酸生物合成的过程大致分为 3 步。第 1
步 : FAS2Ⅰ酶负责以 2 个碳原子的乙酰基团开始 ,
以 2 个碳原子为延长单位不断地延长碳链 ,直至增
加到碳原子数目为 16~18 或 20~26 个的碳链 ,这
些产物部分成为分枝菌酸的α侧链的来源 ,也就是
提供 meromycolic 链 ,同时它又为 FAS2Ⅱ体系中继
续合成更长的碳链提供了起始化合物。第二步 :
FAS2Ⅱ酶参与的链的延长过程 ,即在前面 FAS2Ⅰ
体系合成的前提化合物的基础上通过β2ketoacyl2
ACP 合成酶 ,脱氢酶 , t rans2enoyl2ACP 异构酶环丙
烷合成酶、甲基转移酶等的作用 ,形成了 mycocer2
osic 长度碳数为 56 个以上的长链 , 这部分产物为
分枝菌酸提供了长链部分。第 3 步 :在 P K13 多聚
乙酰合成酶的作用下 ,FAS2Ⅰ合成的产物作为α侧
链 ,FAS2Ⅱ的产物为长链部分发生 Claisen 缩合反
应 ,合成分枝菌酸。所合成的分枝菌酸怎样连接在
海藻糖上形成 TDM 索状结构涉及到一个庞大的体
系 ,还需要许多研究来
,至今还没有很好的合理
的解释。
分枝菌酸生物合成过程中涉及到的一些基因的
功能已被证实[8 - 13 ] ,其中 , fab 编码了多功能 FAS2
Ⅰ系统中的酶 ,acpM , KasA 和 KasB , InhA 主要负
责由 FAS2Ⅰ系统到 FAS2Ⅱ系统的转换并合成
FAS2Ⅱ系统中所需的各种功能的合成酶、还原酶、
异构酶。MmaA2 , PcaA 分别负责α2分枝菌酸中距
离羧基位置的最远端及最近端的环丙烷的形成 ,
P K13 则编码了第 3 步缩合反应中的缩合酶。
在结核分枝杆菌的基因研究的过程中 ,与分枝
菌酸相关的一些功能毒力基因如 Mas ( Rv2940c ,
mas ) , MmaA4 ( Rv0642c , mmaA4 ) , PcaA
( Rv0470c , pcaA ) 等毒力基因的功能得到了证
实[14 ] 。MmaA4 负责编码分枝菌酸的生物合成过程
中的甲基转移化酶 ,若这个基因发生诱变 ,诱变体菌
株将不产生甲基和酮式分枝菌酸。PcaA 负责分枝
菌酸中环丙烷结构形成的甲基转移化酶 ,在 1 个比
较毒力强弱的实验中 ,被 pcaA 诱变株感染的小鼠
的寿命要比野生型结核分枝杆菌感染的长得多。通
过对结核分枝杆菌中毒力基因的发现与研究及毒力
的分析和测定 ,为制造更好的类似 —BCG活细胞疫
苗、DNA 疫苗等提供了前瞻性的研究。
分枝菌酸的生物合成机理及相关的基因的研究
也为抗结核药物的
提供了有潜力的关键的药物
作用靶位。异烟肼作为了一个高效低毒的抗肺结核
药物。对结核菌有很高的专一性[ 5 ] 。Koch2West2
er、Kuni Takayama 等人分别设计了一系列实验证
实了异烟肼经结核菌中唯一带有催化活性的催化过
氧化酶 Kat G活化后变成的次级产物抑制分枝菌酸
的生物合成[16 - 18 ] 。Koch 等将 H37 Rv 菌株放置在
浓度为 015μg/ ml 的异烟肼中处理后发现结核分枝
杆菌失去了它的抗酸染色活性。Kuni Takayama
等人采用14 C 标记的分枝菌酸合成时需要的最起点
物质乙酰酯 ,观察和比较了不加入异烟肼和加入异
烟肼的结核菌体系中分别合成的带有14 C 标记的中
间体浓度随时间的变化 ,发现加入异烟肼后反应体
系中生成的带有放射性标记的化合物的含量显著降
低 , 这些实验结果表明异烟肼抑制了分枝菌酸的生
物合成过程 ,使结核分枝杆菌不能合成细胞壁所需
的分枝菌酸 ,从而阻碍了细胞壁的构建。相反 ,当结
核分枝杆菌产生异烟肼耐药时 , 至少是 kat G ,
i nhA , ahpC 等基因中的 1 个发生了变化。 Kat G
编码的是令异烟肼活化为有效结构的催化过氧化
酶 , 当 Kat G发生变化后 ,异烟肼就无法转化成能
够抑制结核分枝杆菌的有效结构 ,因而产生耐药现
象。异烟肼对 InhA 的抑制是由于异烟肼和 NAD H
形成的加合物可以很“亲合”地结合在 i nhA 编码的
FAS2Ⅱ生物合成过程中烯酰还原酶 , 当 i nhA 基因
变化后 ,异烟肼和 NAD H 的加合物对酶的亲和力
急剧减弱 ,就不能抑制这种酶 ,因而产生了耐药现
象[19 ] 。其他抑制分枝菌酸合成的药物如乙硫异烟
胺[20 ] ( Et hionamide , ET H) 是 1 个很有用的二线药
物 ,它与异烟肼的结构类似 ,虽然它和异烟肼在抑制
分枝菌酸的合成方面有着同等强度的效力 ,但对于
耐药程度的表现却不尽相同。对于耐异烟肼的菌株
对乙硫异烟胺表现出稍微的敏感 ,但耐乙硫异烟胺
的菌株对异烟肼却是敏感的。
4 分枝菌酸的检测方法
由于分枝菌酸是分枝杆菌中独有的成分 ,且不
同类型的分枝杆菌中分枝菌酸的含量和结构类型不
同 , 因此分枝菌酸成了分枝杆菌菌型鉴定中一个非
常有用的标记性化合物 ,它的衍生物在色谱中的不
同指纹图谱可被用于菌型分型。同时由于野生型分
枝杆菌和诱变体所分泌的分枝菌酸的类型不同 ,因
此分枝菌酸在质谱中的不同表现也常被用于基因的
功能研究中。用于分枝菌酸检测的主要色谱方法有
薄层色谱法、气相色谱法和液相色谱法及质谱法。
4. 1 薄层色谱法[ 21 - 24] 薄层色谱法的原理是根据
不同的化合物在展开剂的推进下 ,化合物与薄层板
上的固定相 (如硅胶)之间的吸附作用的不同而进行
分离的 1 种分析方法。利用薄层色谱法对分枝菌酸
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检测的具体方法为 :将培养在 Middlebrook 7 H10
或 7 H11 上的结核菌中的分枝菌酸在浓硫酸的作用
下皂化、甲酯化 ,甲酯化的分枝菌酸被有机溶剂萃取
出来并浓缩后 ,点在高效薄层板上 ,再用不同的溶剂
展开 ,显色后就会有不同 Rf 值的斑点出现在板层
上 ,由于不同的分枝杆菌中所含的分枝菌酸不同 ,因
此就会出现一系列不完全相同的斑点图 ,利用这些
斑点的分布可用来鉴定分枝杆菌的菌种。这种方法
需要的仪器设备简单 ,而且在同一块薄层板上多个
临床菌株可以同时被鉴定 ,但由于薄层分离的分离
度的影响 ,需要培养大量的菌 (50 mg 左右) ,需要使
用几种展开溶剂系统 ,喷洒不同的显色剂 ,这些不便
限制了其在临床上快速检测中的应用。
4. 2 气相色谱法 气相色谱法的原理是 :化合物在
载气的推动下 ,在前进过程中与气相毛细管柱中的
填料之间的发生不断的吸附2解吸附作用 ,从而使不
同的化合物得到分离。像鉴定其他细菌一样 ,利用
气相色谱法根据细胞壁中常规的脂肪酸含量及种类
的不同经甲酯化后而给出不同的气相色谱图 ,用于
判断细菌的类型。同样原理 ,也可通过结核菌中的
脂肪酸的气相色谱法测定来鉴定结核菌的类型。通
过这种方法 Iris 等人对 1 077 株临床菌株进行分
型 ,符合率为 9815 %[25 - 26 ] 。但对于结核菌中的分
枝菌酸来说 ,由于它的碳链很长 ,相对分子量很大 ,
即使甲酯化后也很难气化 ,无法直接进入气相色谱
系统。因此只能使用热解或碱性条件下的水
解[27 - 29 ] ,使大分子从β2羟基处断裂形成 C24 或 C26
的脂肪酸 ,断链后的脂肪酸经甲酯化后进行分析。
在热解时需要注意的是裂解的温度和时间 ,文献报
道随着裂解时间的延长和裂解温度的升高 ,C24 或
C26 的色谱峰的峰高会增加 ,峰形更尖锐 ,这不同于
普通的短链脂肪酸 ,它们的量并不会因为裂解温度
的高低或裂解时间的长短而变化。考虑到实验过程
中的生物安全问题 ,Mary A1 Lambert [30 ] 等人专门
比较了活菌直接皂化、甲酯化和高温高压灭菌后再
皂化甲酯化得到的分枝菌酸裂解产物的色谱峰的个
数及含量 ,发现高温高压灭菌对测定是没有影响的。
4. 3 液相色谱法 液相色谱法的原理是利用化合
物在液体流动相的推动下 ,不同的化合物与液相色
谱柱中的填料的吸附作用及其在流动相中的分配作
用的不同而进行分离。用液相色谱法来检测分枝菌
酸的方法自 20 世纪 90 年代开始已逐步成熟起来。
由于分枝菌酸链的长度和不饱和度及官能团的不
同 ,溴化衍生后的分枝菌酸表现在液相图谱上的峰
的形状和个数以及峰与峰之间的峰高的比值是不同
的 ,不同的结核分枝杆菌菌株中分枝菌酸的类型及
含量是不同的 ,而同种分枝杆菌给出的液相图谱上
的峰的个数及比例是不变的 ,因此根据不同的指纹
图谱就可以区分不同型的结核菌株[31 ] 。在用液相
色谱法鉴定结核杆菌类型时 ,有些研究小组还发现
培养温度的不同也是影响结核菌分型的因素之一 ,
如 M1 Chelonae1 (龟分枝杆菌) 在 28 ℃和 35 ℃下分
别培养得到的结核菌株的图谱是不同的 ,峰高发生了
明显的变化[32 ] 。
在最初使用液相方法测定分枝菌酸时 ,使用的
是紫外检测器来识别分枝菌酸的波谱峰 ,后来发现
分枝菌酸被荧光衍生化后的荧光衍生物的检测灵敏
度是紫外吸收法 (分枝菌酸被衍生为 p2bromo2
p henacyl esters PBPA) 20 多倍[33 ] ,因此荧光法代替
了紫外吸收法 ,现在美国疾病预防控制中心推荐使
用的 Sherlock 结核杆菌鉴定系统使用的就是液相
色谱2荧光检测法。这种方法被广泛被应用于美国
多家医院临床菌株的鉴定中。
液相色谱法除了被用来鉴定菌型外 , 最近
Nicole Parrish 报道了令人比较感兴趣的工作是通
过测定分枝菌酸的浓度变化规律来判断结核菌耐药
结果。分枝菌酸的抑制剂异烟肼在短时间内可以引
起分枝菌酸相当显著的浓度变化 ,结核分枝杆菌在
含有异烟肼的培养基中孵育 20 min 之后就可以观
察到分枝菌酸浓度的明显下降 ,其他药物如利福平、
链霉素、乙胺丁醇等 ,由于不是分枝菌酸抑制剂不会
给出迅速下降的信号 ,但培养 5 d 之后 ,也能得出相
应的变化曲线 ,根据不同药物培养基中分枝菌酸的
变化趋势判断耐药结果[34 ] 。这个研究结果也为药
物敏感性实验提供了一种新的思路。
4. 4 质谱法 以上提到的气相色液相谱法等方法
一般都是根据不同分枝杆菌给出不同的分枝菌酸的
色谱图来判断不同菌属的菌株 ,但对于分枝菌酸具
体的结构无法分析。质谱法为不同结构的分枝菌酸
的分析提供了很大的帮助 ,它能够提示分枝菌酸具
体的种类和质量数 ,进而帮助推断更加详细的分枝
菌酸的结构。Francoise Laval 等人在进行基因功能
的研究时 ,利用 MALDI2TO F 质谱法比较了野生的
H37 Rv 与它的同基因诱变体 ( hma 基因失活) 的菌
株中产生的分枝菌酸的变化 ,发现诱变株中的分枝
菌酸结构发生了明显的变化 ,失去了酮基和甲氧基 ,
正是由于分枝菌酸上这 2 个官能团的失去 ,导致细
胞壁对小分子化合物的渗透力发生了巨大变化。用
诱变菌株感染小鼠时发现它的毒力也明显减弱。由
此可以看出分枝菌酸的质谱分析为毒力基因的功能
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研究提供了有力的工具[35 ] 。
5 结束语
分枝菌酸的生物合成机理及相关的基因的研究
为抗结核药物的设计提供了有潜力的关键的药物作
用靶位[36 ] 。随着对与细胞壁形成有关的生物化学过
程的理解 ,在分枝菌酸生物合成过程中涉及到的许多
酶成了可进一步研究探索的靶点。例如对分枝菌酸
生物合成过程中的酶有抑制作用的著名的新抗结核
药物 PA2824 ,它是从一个含有 328 个化合物的库中
筛选出来的非常有潜力的抗耐药结核药物。目前该
药物已进入临床试验阶段。尽管新的抗结核药物产
生的过程是艰难和漫长的 ,但随着结核杆菌功能基因
的研究、计算机模拟药物化学、酶学及有机合成技术
的不断发展 ,更有效的抗结核新药一定会不断产生。
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(收稿日期 :2009 - 11 - 9)
(本文编辑 :张晓进)
·通知 ·
中国防痨协会临床委员会、基础委员会
学术研讨会征文通知
中国防痨协会结核病临床专业委员会、基础细菌免疫专业委员会定于 2010 年 10 月 15 —18 日在上海召
开专题学术研讨会 ,主题为“结核病诊疗新进展”。自即日起征集学术交流论文。
1. 征文内容 :中国结核病控制策略和方法 ;结核病基础、临床、流行病学 ;健康教育 ;护理 ;抗结核药物 ;
结核病诊断与疫苗 ;耐药结核病 ;流动人口结核病防治 ; TB/ H IV 双重感染的国内外进展、科研成果和我国
结核病防治工作实施经验 ,呼吸系统疾病及吸烟与健康等相关内容。
2. 征文要求 : (1)所送论文均应为未公开发表的论文。(2)文责自负 ,征文文字应准确无误。一律为电子
版。电子版发至下述邮箱 (以 Word 格式存盘) 。论文纸质版 1 份附单位介绍信并盖章 ,注明为会议交流征
文 ; (4)务必写清第一作者姓名、工作单位、通讯地址、邮政编码、联系电话。截稿日期为 2010 年 8 月 31 日。
3. 凡参加本次学术会议的论文 ,经审稿后将刊载于《中国防痨杂志》2010 年专刊上。论文评审费 160
元。版面费按正刊
收取。评审费请寄北京西城区东光胡同 5 号 (100035)《中国防痨杂志》编辑部。
4. 联系地址和方法 : (1) 北京西城区东光胡同 5 号 (100035) ,中国防痨杂志编辑部 ,信封上注明“征文”
字样。(2)联系人 :李树萍、丁北川。(3) 联系电话 (传真) : (010) 62257587 (李树萍) ; (010) 62276766 - 1214
(丁北川) ; (4) Email :zgflxh @126. com。
·204· 2010 年 7 月 第 32 卷 第 7 期