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结核分枝杆菌中的分枝菌酸

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结核分枝杆菌中的分枝菌酸   通讯作者 :梅建 (meijiansh @yahoo . com. cn) ·综述 · 结核分枝杆菌中的分枝菌酸 孙丕  梅建 (上海市疾病预防控制中心  上海  200336)   肺结核是一种由结核分枝杆菌感染引起的呼吸 道传染病 ,比较容易在密集的人群中传播而导致公 共卫生问题。20 多年前肺结核已经得到了基本控 制 ,但是 ,近年来结核病发病率逐年上升 ,死灰复燃 , 又成为全球范围内潜在的致病源 , 每年可以导致 200 万人死亡。由于无法提供充足的临床药物及不 正确的用药方式 ,出现了耐药性结核。近年...
结核分枝杆菌中的分枝菌酸
  通讯作者 :梅建 (meijiansh @yahoo . com. cn) ·综述 · 结核分枝杆菌中的分枝菌酸 孙丕  梅建 (上海市疾病预防控制中心  上海  200336)   肺结核是一种由结核分枝杆菌感染引起的呼吸 道传染病 ,比较容易在密集的人群中传播而导致公 共卫生问题。20 多年前肺结核已经得到了基本控 制 ,但是 ,近年来结核病发病率逐年上升 ,死灰复燃 , 又成为全球范围内潜在的致病源 , 每年可以导致 200 万人死亡。由于无法提供充足的临床药物及不 正确的用药方式 ,出现了耐药性结核。近年来 ,艾滋 病患者合并结核菌感染更是引起了关注 ,因为艾滋 病病人本身脆弱的免疫系统致使他们很容易感染结 核菌 , 而且一旦感染会经常导致死亡。由于结核分 枝杆菌的生长、致病性、对药物的耐药性以及抗酸特 性都和细胞壁中所含有的分枝菌酸有关。本文从分 枝菌酸在细胞壁中的位置、分子结构的多样性、生物 合成的过程和抑制分枝菌酸的生物合成的药物异烟 肼及其在耐药方面的作用、检测方法等方面进行综 述 ,以期待对分枝菌酸有更深入的了解。 1  分枝菌酸在结核菌细胞壁中的位置 分枝菌酸是 Stodola 等人首次于 1938 年从结 核分枝杆菌中提取的不同于常规脂肪酸的 1 种大相 对分子量的疏水性的α2羟基脂肪酸。它区别于其 他菌类脂肪酸的特征性化学结构是具有一个碳数为 22~26 个的短臂和一个碳数为 50~60 个的长臂。 在结核分枝杆菌的细胞壁中 ,分枝菌酸和其中的一 种重要的多糖2阿拉伯半乳聚糖连接 ,阿拉伯半乳聚 糖通过磷脂键又连接在维持结核菌骨架结构并保持 它们的形状的肽聚糖上。分枝菌酸是通过其分子中 的羧基与阿拉伯半乳聚糖中的羟基通过酯键垂直连 接在阿拉伯半乳聚糖上 ,而结核菌壁外层的其他糖 脂和游离脂类则嵌在分枝菌酸之中[ 1 ] (图 1) 。这些 包含分枝菌酸在内的脂质成分构成了独特的细胞壁 结构 ,由于这层厚厚的疏水性渗透屏障相当紧密 ,从 而能够保护细菌不受外来有毒化学物质的侵害。在 这层保护层下 ,结核分枝杆菌能有效地避开宿主的 图 1  分枝菌酸在结核菌细胞壁中的位置 免疫系统 ,使其很容易在巨噬细胞中生长。这层保 护层中的分枝菌酸是结核菌镜检染色实验 Ziehl2 Neelsen 以及荧光染色实验中分别和石碳酸酚红及 金胺发生显色反应的唯一抗酸物质[2 ] 。同时不同结 构的分枝菌酸还和结核杆菌的毒力相关。 2  分枝菌酸结构的多样性及结构与毒力的 关系 分枝菌酸不仅存在于分枝杆菌属中 ,还存在于诺 卡菌属、红球菌属、棒状杆菌属中 ,是细胞壁中的主要 成分 ,占细胞干重的 40 %~60 % ,结核分枝杆菌的致 病性和它相应的细胞壁的结构与成分密切相关。 分枝菌酸的结构是通过 TL C、GC、HPL C 及 NMR 分析技术确定的。不同菌属的菌株中所含的 分枝菌酸的碳链的长度是不同的。在棒状杆菌 (Corynebacterium)中 ,碳链中碳原子的个数在 20~ 38 之间 ;在诺卡菌 (Nocardia) 中碳链的长度在40~ 60 之间。在结核分枝杆菌中 ,分枝菌酸的典型结构 为一个含有羧基和羟基官能团的 60~90 个碳长的 线性长链 ,其中 ,在羧基的α2位带着烷基侧链 ,α2位 为羟基 ,而羧基的α2位所带的侧链通常是含有 22~ 24 个碳原子的烷基链。从终端为甲基的碳开始到 含有羟基的碳结束的这段碳链称为 meromycolic 链 ,而另一端则称为 mycocerosic 链。 在结核分枝杆菌中分枝菌酸主要有 3 类结构 , 即α2分枝菌酸 ,酮 ( keto)2分枝菌酸和甲氧基 ( me2 ·793· 2010 年 7 月 第 32 卷 第 7 期 Ⅰ为α2分枝菌酸 ,它只有顺式结构。Ⅱa 与 Ⅱb 属于甲氧类型 的分枝菌酸 , Ⅱa 是顺式 , Ⅱb 是反式结构。Ⅲa 和 Ⅲb 属于酮基分枝菌酸 , Ⅲa 是顺式 , Ⅲb 是反式结构 图 2  Mtb 中分离出的分枝菌酸的化学结构 狋犺狅狓狔)分枝菌酸 (图 2) 。极性最小的α2分枝菌酸的 含量是最高的 ,而甲氧基和酮基类型的分枝菌酸相 对含量较少。在非结核分枝杆菌中还存在有其他结 构的分枝菌酸 ,如在 S1 smegmatis 耻垢分枝杆菌中 , 就包含有α1、α’等类型 ,其结构的差异只是分子结 构中的环丙烷官能团被双键或环氧丙烷所替代。α’ 型分枝菌酸 ,极性稍强 ,相对分子量较低 ,含 60~68 个碳 ,在 TL C 薄层上很容易与α2分枝菌酸分开[3 ] 。 α2分枝菌酸含有顺式的环丙烷张力环 ,另 2 种类型 的分枝菌酸则带有远离羧基端含氧的官能团。这些 氧化了的官能团包括酮基、甲氧基团 ,它们分别分为 顺式和反式结构。这些官能团中 ,双键、甲基和环丙 烷基属于非极性官能团 ,而酮基和甲氧基属于极性 官能团。这些官能团的不同极性可引起细胞壁的变 化 ,如在最远端的环丙烷官能团的存在可以提高结 核菌对外界氧化杀伤的耐受力 ,同时环丙基的存在 也限制了细胞壁的流动性[4 ] 。 酮基和甲氧基分枝菌酸的存在与否可以明显改 变细胞壁的渗透性能 ,渗透力的降低使得结核分枝 杆菌对生长过程中所使用的特殊的营养成分的利用 度发生改变 ,使得结核分枝杆菌的存活率降低 ,表现 为结核分枝杆菌的毒力减低。这些不同类型的分枝 菌酸通过不同的组合构成了具有不同毒力的菌群。 值得注意的是 ,分枝菌酸的单链上的一个微小的变 化 ,就可以引起结核杆菌毒力的变化 ,如分枝菌酸中 的环丙烷被双键替代 ,就会影响与海藻糖相联接的 索状结构的形成从而影响了其毒力。 3  分枝菌酸的生物合成、相关毒力基因及抑 制分枝菌酸的生物合成的药物异烟肼及 其耐药的产生 结核分枝杆菌的分枝菌酸的生物合成和其他微 生物如酵母真菌等中脂肪酸的生物合成过程既有相 似的地方也有其独特的地方。在过去多年研究中 , 已经积累了大量的关于分枝菌酸是怎样被合成并组 装衍变成最后的产物的研究成果 ,其生物合成的途 径与机理也得到了验证[5 - 7 ] 。早在 1977 年 Bloch 和他的同事就证实了在分枝杆菌中存在着对其生物 合成起作用的 2 种类型的多功能酶混合体 ,即 Ⅰ型 和 Ⅱ型脂肪酸合成酶 ( FAS2Ⅰ, FAS2Ⅱ) 。一般认 ·893·  2010 年 7 月 第 32 卷 第 7 期 为 ,分枝菌酸生物合成的过程大致分为 3 步。第 1 步 : FAS2Ⅰ酶负责以 2 个碳原子的乙酰基团开始 , 以 2 个碳原子为延长单位不断地延长碳链 ,直至增 加到碳原子数目为 16~18 或 20~26 个的碳链 ,这 些产物部分成为分枝菌酸的α侧链的来源 ,也就是 提供 meromycolic 链 ,同时它又为 FAS2Ⅱ体系中继 续合成更长的碳链提供了起始化合物。第二步 : FAS2Ⅱ酶参与的链的延长过程 ,即在前面 FAS2Ⅰ 体系合成的前提化合物的基础上通过β2ketoacyl2 ACP 合成酶 ,脱氢酶 , t rans2enoyl2ACP 异构酶环丙 烷合成酶、甲基转移酶等的作用 ,形成了 mycocer2 osic 长度碳数为 56 个以上的长链 , 这部分产物为 分枝菌酸提供了长链部分。第 3 步 :在 P K13 多聚 乙酰合成酶的作用下 ,FAS2Ⅰ合成的产物作为α侧 链 ,FAS2Ⅱ的产物为长链部分发生 Claisen 缩合反 应 ,合成分枝菌酸。所合成的分枝菌酸怎样连接在 海藻糖上形成 TDM 索状结构涉及到一个庞大的体 系 ,还需要许多研究来 ,至今还没有很好的合理 的解释。 分枝菌酸生物合成过程中涉及到的一些基因的 功能已被证实[8 - 13 ] ,其中 , fab 编码了多功能 FAS2 Ⅰ系统中的酶 ,acpM , KasA 和 KasB , InhA 主要负 责由 FAS2Ⅰ系统到 FAS2Ⅱ系统的转换并合成 FAS2Ⅱ系统中所需的各种功能的合成酶、还原酶、 异构酶。MmaA2 , PcaA 分别负责α2分枝菌酸中距 离羧基位置的最远端及最近端的环丙烷的形成 , P K13 则编码了第 3 步缩合反应中的缩合酶。 在结核分枝杆菌的基因研究的过程中 ,与分枝 菌酸相关的一些功能毒力基因如 Mas ( Rv2940c , mas ) , MmaA4 ( Rv0642c , mmaA4 ) , PcaA ( Rv0470c , pcaA ) 等毒力基因的功能得到了证 实[14 ] 。MmaA4 负责编码分枝菌酸的生物合成过程 中的甲基转移化酶 ,若这个基因发生诱变 ,诱变体菌 株将不产生甲基和酮式分枝菌酸。PcaA 负责分枝 菌酸中环丙烷结构形成的甲基转移化酶 ,在 1 个比 较毒力强弱的实验中 ,被 pcaA 诱变株感染的小鼠 的寿命要比野生型结核分枝杆菌感染的长得多。通 过对结核分枝杆菌中毒力基因的发现与研究及毒力 的分析和测定 ,为制造更好的类似 —BCG活细胞疫 苗、DNA 疫苗等提供了前瞻性的研究。 分枝菌酸的生物合成机理及相关的基因的研究 也为抗结核药物的提供了有潜力的关键的药物 作用靶位。异烟肼作为了一个高效低毒的抗肺结核 药物。对结核菌有很高的专一性[ 5 ] 。Koch2West2 er、Kuni Takayama 等人分别设计了一系列实验证 实了异烟肼经结核菌中唯一带有催化活性的催化过 氧化酶 Kat G活化后变成的次级产物抑制分枝菌酸 的生物合成[16 - 18 ] 。Koch 等将 H37 Rv 菌株放置在 浓度为 015μg/ ml 的异烟肼中处理后发现结核分枝 杆菌失去了它的抗酸染色活性。Kuni Takayama 等人采用14 C 标记的分枝菌酸合成时需要的最起点 物质乙酰酯 ,观察和比较了不加入异烟肼和加入异 烟肼的结核菌体系中分别合成的带有14 C 标记的中 间体浓度随时间的变化 ,发现加入异烟肼后反应体 系中生成的带有放射性标记的化合物的含量显著降 低 , 这些实验结果表明异烟肼抑制了分枝菌酸的生 物合成过程 ,使结核分枝杆菌不能合成细胞壁所需 的分枝菌酸 ,从而阻碍了细胞壁的构建。相反 ,当结 核分枝杆菌产生异烟肼耐药时 , 至少是 kat G , i nhA , ahpC 等基因中的 1 个发生了变化。 Kat G 编码的是令异烟肼活化为有效结构的催化过氧化 酶 , 当 Kat G发生变化后 ,异烟肼就无法转化成能 够抑制结核分枝杆菌的有效结构 ,因而产生耐药现 象。异烟肼对 InhA 的抑制是由于异烟肼和 NAD H 形成的加合物可以很“亲合”地结合在 i nhA 编码的 FAS2Ⅱ生物合成过程中烯酰还原酶 , 当 i nhA 基因 变化后 ,异烟肼和 NAD H 的加合物对酶的亲和力 急剧减弱 ,就不能抑制这种酶 ,因而产生了耐药现 象[19 ] 。其他抑制分枝菌酸合成的药物如乙硫异烟 胺[20 ] ( Et hionamide , ET H) 是 1 个很有用的二线药 物 ,它与异烟肼的结构类似 ,虽然它和异烟肼在抑制 分枝菌酸的合成方面有着同等强度的效力 ,但对于 耐药程度的表现却不尽相同。对于耐异烟肼的菌株 对乙硫异烟胺表现出稍微的敏感 ,但耐乙硫异烟胺 的菌株对异烟肼却是敏感的。 4  分枝菌酸的检测方法 由于分枝菌酸是分枝杆菌中独有的成分 ,且不 同类型的分枝杆菌中分枝菌酸的含量和结构类型不 同 , 因此分枝菌酸成了分枝杆菌菌型鉴定中一个非 常有用的标记性化合物 ,它的衍生物在色谱中的不 同指纹图谱可被用于菌型分型。同时由于野生型分 枝杆菌和诱变体所分泌的分枝菌酸的类型不同 ,因 此分枝菌酸在质谱中的不同表现也常被用于基因的 功能研究中。用于分枝菌酸检测的主要色谱方法有 薄层色谱法、气相色谱法和液相色谱法及质谱法。 4. 1  薄层色谱法[ 21 - 24]  薄层色谱法的原理是根据 不同的化合物在展开剂的推进下 ,化合物与薄层板 上的固定相 (如硅胶)之间的吸附作用的不同而进行 分离的 1 种分析方法。利用薄层色谱法对分枝菌酸 ·993· 2010 年 7 月 第 32 卷 第 7 期 检测的具体方法为 :将培养在 Middlebrook 7 H10 或 7 H11 上的结核菌中的分枝菌酸在浓硫酸的作用 下皂化、甲酯化 ,甲酯化的分枝菌酸被有机溶剂萃取 出来并浓缩后 ,点在高效薄层板上 ,再用不同的溶剂 展开 ,显色后就会有不同 Rf 值的斑点出现在板层 上 ,由于不同的分枝杆菌中所含的分枝菌酸不同 ,因 此就会出现一系列不完全相同的斑点图 ,利用这些 斑点的分布可用来鉴定分枝杆菌的菌种。这种方法 需要的仪器设备简单 ,而且在同一块薄层板上多个 临床菌株可以同时被鉴定 ,但由于薄层分离的分离 度的影响 ,需要培养大量的菌 (50 mg 左右) ,需要使 用几种展开溶剂系统 ,喷洒不同的显色剂 ,这些不便 限制了其在临床上快速检测中的应用。 4. 2  气相色谱法  气相色谱法的原理是 :化合物在 载气的推动下 ,在前进过程中与气相毛细管柱中的 填料之间的发生不断的吸附2解吸附作用 ,从而使不 同的化合物得到分离。像鉴定其他细菌一样 ,利用 气相色谱法根据细胞壁中常规的脂肪酸含量及种类 的不同经甲酯化后而给出不同的气相色谱图 ,用于 判断细菌的类型。同样原理 ,也可通过结核菌中的 脂肪酸的气相色谱法测定来鉴定结核菌的类型。通 过这种方法 Iris 等人对 1 077 株临床菌株进行分 型 ,符合率为 9815 %[25 - 26 ] 。但对于结核菌中的分 枝菌酸来说 ,由于它的碳链很长 ,相对分子量很大 , 即使甲酯化后也很难气化 ,无法直接进入气相色谱 系统。因此只能使用热解或碱性条件下的水 解[27 - 29 ] ,使大分子从β2羟基处断裂形成 C24 或 C26 的脂肪酸 ,断链后的脂肪酸经甲酯化后进行分析。 在热解时需要注意的是裂解的温度和时间 ,文献报 道随着裂解时间的延长和裂解温度的升高 ,C24 或 C26 的色谱峰的峰高会增加 ,峰形更尖锐 ,这不同于 普通的短链脂肪酸 ,它们的量并不会因为裂解温度 的高低或裂解时间的长短而变化。考虑到实验过程 中的生物安全问题 ,Mary A1 Lambert [30 ] 等人专门 比较了活菌直接皂化、甲酯化和高温高压灭菌后再 皂化甲酯化得到的分枝菌酸裂解产物的色谱峰的个 数及含量 ,发现高温高压灭菌对测定是没有影响的。 4. 3  液相色谱法  液相色谱法的原理是利用化合 物在液体流动相的推动下 ,不同的化合物与液相色 谱柱中的填料的吸附作用及其在流动相中的分配作 用的不同而进行分离。用液相色谱法来检测分枝菌 酸的方法自 20 世纪 90 年代开始已逐步成熟起来。 由于分枝菌酸链的长度和不饱和度及官能团的不 同 ,溴化衍生后的分枝菌酸表现在液相图谱上的峰 的形状和个数以及峰与峰之间的峰高的比值是不同 的 ,不同的结核分枝杆菌菌株中分枝菌酸的类型及 含量是不同的 ,而同种分枝杆菌给出的液相图谱上 的峰的个数及比例是不变的 ,因此根据不同的指纹 图谱就可以区分不同型的结核菌株[31 ] 。在用液相 色谱法鉴定结核杆菌类型时 ,有些研究小组还发现 培养温度的不同也是影响结核菌分型的因素之一 , 如 M1 Chelonae1 (龟分枝杆菌) 在 28 ℃和 35 ℃下分 别培养得到的结核菌株的图谱是不同的 ,峰高发生了 明显的变化[32 ] 。 在最初使用液相方法测定分枝菌酸时 ,使用的 是紫外检测器来识别分枝菌酸的波谱峰 ,后来发现 分枝菌酸被荧光衍生化后的荧光衍生物的检测灵敏 度是紫外吸收法 (分枝菌酸被衍生为 p2bromo2 p henacyl esters PBPA) 20 多倍[33 ] ,因此荧光法代替 了紫外吸收法 ,现在美国疾病预防控制中心推荐使 用的 Sherlock 结核杆菌鉴定系统使用的就是液相 色谱2荧光检测法。这种方法被广泛被应用于美国 多家医院临床菌株的鉴定中。 液相色谱法除了被用来鉴定菌型外 , 最近 Nicole Parrish 报道了令人比较感兴趣的工作是通 过测定分枝菌酸的浓度变化规律来判断结核菌耐药 结果。分枝菌酸的抑制剂异烟肼在短时间内可以引 起分枝菌酸相当显著的浓度变化 ,结核分枝杆菌在 含有异烟肼的培养基中孵育 20 min 之后就可以观 察到分枝菌酸浓度的明显下降 ,其他药物如利福平、 链霉素、乙胺丁醇等 ,由于不是分枝菌酸抑制剂不会 给出迅速下降的信号 ,但培养 5 d 之后 ,也能得出相 应的变化曲线 ,根据不同药物培养基中分枝菌酸的 变化趋势判断耐药结果[34 ] 。这个研究结果也为药 物敏感性实验提供了一种新的思路。 4. 4  质谱法  以上提到的气相色液相谱法等方法 一般都是根据不同分枝杆菌给出不同的分枝菌酸的 色谱图来判断不同菌属的菌株 ,但对于分枝菌酸具 体的结构无法分析。质谱法为不同结构的分枝菌酸 的分析提供了很大的帮助 ,它能够提示分枝菌酸具 体的种类和质量数 ,进而帮助推断更加详细的分枝 菌酸的结构。Francoise Laval 等人在进行基因功能 的研究时 ,利用 MALDI2TO F 质谱法比较了野生的 H37 Rv 与它的同基因诱变体 ( hma 基因失活) 的菌 株中产生的分枝菌酸的变化 ,发现诱变株中的分枝 菌酸结构发生了明显的变化 ,失去了酮基和甲氧基 , 正是由于分枝菌酸上这 2 个官能团的失去 ,导致细 胞壁对小分子化合物的渗透力发生了巨大变化。用 诱变菌株感染小鼠时发现它的毒力也明显减弱。由 此可以看出分枝菌酸的质谱分析为毒力基因的功能 ·004·  2010 年 7 月 第 32 卷 第 7 期 研究提供了有力的工具[35 ] 。 5  结束语 分枝菌酸的生物合成机理及相关的基因的研究 为抗结核药物的设计提供了有潜力的关键的药物作 用靶位[36 ] 。随着对与细胞壁形成有关的生物化学过 程的理解 ,在分枝菌酸生物合成过程中涉及到的许多 酶成了可进一步研究探索的靶点。例如对分枝菌酸 生物合成过程中的酶有抑制作用的著名的新抗结核 药物 PA2824 ,它是从一个含有 328 个化合物的库中 筛选出来的非常有潜力的抗耐药结核药物。目前该 药物已进入临床试验阶段。尽管新的抗结核药物产 生的过程是艰难和漫长的 ,但随着结核杆菌功能基因 的研究、计算机模拟药物化学、酶学及有机合成技术 的不断发展 ,更有效的抗结核新药一定会不断产生。 6  参考文献 [ 1 ] Chat terjee D1 The mycobacterial cell wall :st ructure , biosynt he2 sis and sites of drug action [J ] . 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