沙眼衣原体感染实验室诊断

沙眼衣原体感染的实验室诊断河北省疾病预防控制中心性病艾滋病防治所赵翠英病原体淋球菌梅毒螺旋体生殖器疱疹病毒生殖道沙眼衣原体乳头瘤病毒HIV病毒杜克雷噬血杆菌衣原体念珠菌滴虫疥虫阴虱肝炎病毒－－－病种淋病梅毒:生殖器疱疹:生殖道沙眼衣原体感染:尖锐湿疣:HIV感染/艾滋病:软下疳:性病性淋巴肉芽肿:念珠菌性阴道炎:滴虫性阴道病:疥疮:阴虱病:肝炎（乙、丙）：－－－性传播疾病(STD)/性传播感染(STI)梅毒淋病软下疳性病性淋巴肉芽肿非淋菌性尿道炎生殖器疱疹尖锐湿疣HIV/AIDS梅毒淋病软下疳性病性淋巴肉芽肿50-60年代经典性病80-90年代监测性病目前传染法病例监测性病梅毒淋病沙眼衣原体感染生殖器疱疹尖锐湿疣我国主要流行的性传播疾病（性病）沙眼衣原体:30%～50%生殖支原体:10%～40%其它:20%～30%梅毒淋病HIV/AIDS2007年卫生部《全国性病监测》要求 监测性病5种：TP，NG，CT,HSV,HPV 沙眼衣原体作为独立病种报病 沙眼衣原体感染后： 约70％女性和50％男性为无症状 86％的女性和55％的男性感染者持续感染时间为1年以上。 不寻求治疗……. 可逆行感染： 1.女性：盆腔炎、输卵管炎、不孕、流产和死胎等 2.男性：附睾炎、前列腺炎和不育 3.新生儿：结膜炎、肺炎及Reiter综合征（反应性关节炎） 近年来研究： 引起活动性关节炎，与动脉硬化、冠心病有关；细胞内生长导致与HIV感染的促进作用 沙眼衣原体感染已成为全世界范围的公共卫生问题!实验室检测是控制传播的最有效手段 一级预防：倡导性行为的改变（推迟首次性交年龄，减少性伴，使用安全套等） 二级预防：检测与治疗（性病患者及性伴；孕妇新生儿；普通人群无症状感染传播 三级预防：检测与治疗并发症沙眼衣原体感染病例定义《全国性病监测方案》,2007 流行病学史：有不安全性行为，或性伴感染史 临床现;男性尿道炎、附睾炎等，女性宫颈炎、盆腔炎 实验室检查：CT抗原或核酸或培养阳性 确诊病例：符合1+2+3或2+3者， 无症状感染病例：符合3且没有临床症状者。沙眼衣原体生物学特性 衣原体属微生物 具有细胞壁、核糖体、DNA和RNA 具有合成蛋白质、核酸和脂类的能力 不能产生三磷酸腺苷（ATP），完全依靠宿主细胞提供必须的能量沙眼衣原体病原学 具有原体和始体二个发育型 原体有传染性。原体一旦进入细胞内，就发育为始体 始体具有新陈代谢活性，行二分裂增殖，生长成具有传染性的原体，然后释放出来去感染邻近的细胞 从感染细胞到释放出原体大约需要35-48小时 严格细胞内寄生 生活特性：原体和始体 正常生活周期持续性感染沙眼衣原体病原学沙眼衣原体血清分型和致病性沙眼衣原体有15个血清型,A,B,Ba,C,D-K,L1,L2,L3－A，B，Ba和C型最常引起沙眼－D-K型主要感染泌尿生殖道－L1,L2,L3型引起性病性淋巴肉芽肿物理和化学因素对沙眼衣原体的影响 温度衣原体对热敏感，其传染性在60℃10分钟完全丧失 化学制剂衣原体很容易被乙醚、福尔马林、酚等化学制剂灭活发病机理 衣原体感染人体后，→柱状上皮→单核巨噬细胞→繁殖→细胞死亡， 细胞内增值可逃避宿主免疫防御功能，得到间歇性保护。 衣原体的致病机理是抑制被感染细胞代谢，溶解破坏细胞并导致溶解酶释放，代谢产物的细胞毒作用，引起变态反应和自身免疫。沙眼衣原体的检测常用实验室方法 标本涂片染色直接镜检 抗原检测试验,包括衣原体抗原免疫快速法、直接免疫荧光法和酶联免疫吸附试验 核酸检测，多采用实时荧光PCR法 细胞培养法一、直接涂片法（姬姆萨染色）：方法：涂片－姬姆萨染色－镜检包涵体沙眼衣原体包涵体姬姆萨染色临床应用： 眼部感染：敏感性95％， 男性尿道：敏感性15％， 宫颈感染：敏感性41％。 应用范围：眼部标本。二、沙眼衣原体抗原检测试剂盒-艾博检测方法 使用前将试剂、裂解液和样本恢复到室温（15-30℃）。 1将试剂放置在干净的水平台面上； 2在裂解管中竖直滴入无色的裂解液A5滴，立即放入棉签样本（宫颈拭子），用手指挤压裂解管中的棉签头，并转动棉签15次，静置2分钟；检测方法 3在同一裂解管中竖直滴入裂解液B6滴，混合液可能产生沉淀为正常现象。用手指挤压裂解管中的棉签头，并转动棉签15次，此时溶液呈淡蓝色。静置1分钟； 4挤干裂解管中的棉签头，弃去棉签，盖上并旋紧裂解管滴头； 5在试剂的加样孔中滴入3滴裂解后溶液； 610～20分钟判读结果，20分钟后判读无效。 检验结果的解释 1阳性（+）：出现两条红色条带，位于检测区（T）和质控区（C）。 阳性结果表明：样本中含有衣原体抗原。 2阴性（-）：仅在质控区（C）出现一条红色条带，在检测区（T）无红色条带出现。阴性结果表明：样本中检测不出衣原体抗原，或是含量低于可检测范围。 检验结果的解释 3无效：在质控区（C）未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏。 4注意：检测区（T）内的红色条带可显现出不同深浅的颜色。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只有非常弱的色带也该判为阳性结果“立明”衣原体抗原免疫快速法试验1.原理该实验是检测寄生於尿道或宫颈柱状上皮细胞内的沙眼衣原体抗原的快速免疫方法。(1).标本加提取缓冲液经80℃水浴加热,使衣原体脂多糖(LPS)抗原释放。(2).加标本提取液到含有带色乳胶标记的鼠抗衣原体LPS单克隆抗体的测试卡检体窗中,作用15分钟。 (3).如标本中含有衣原体LPS抗原,可与上述标记的单抗结合,结合物可通过毛细管作用移动到结果窗,并可被该处所含有的未标记的鼠抗衣原体LPS单抗所捕捉,阳性时在结果窗中形成一条可见的兰色带,过剩的未结合的带色乳胶标记的鼠抗衣原体LPS单抗可移动到质控窗,与该处的兔抗鼠抗体相结合,显现一条兰色带。2.检测方法(1).先将试剂、测试卡、塑料管置室温30分钟复温。(2).预备80℃±2℃水浴。(3).加试剂1至塑料管刻度(约0.6ml)。(4).将拭子标本浸入管内混匀,置水浴80℃±2℃,10-12分钟提取LPS抗原,取出后,转动拭子并沿管壁挤压,弃去拭子。提取液置室温冷却后盖回管塞(此液置室温3小时内不影响结果)。(5).将测试卡平置台面上,逐滴加入5滴提取液于检体窗,静置15分钟后观察结果。(6).结果质控窗:显示一条兰带,表明卡片质量可靠,如30分钟内无兰带显示,应另取测试卡进行试验。结果窗：阳性时显示一条深浅不同的兰带,强阳性者可在15分钟内出现,一般一小时后作出报告。质控窗和结果窗的兰带深浅可能不同，不影响结果的解释。(7).质控：取试剂2加5滴於塑料管,再加试剂1至刻度,以下操作同4-5,结果应在质控窗和结果窗均显示一条兰带。3.注意事项(1).本试剂盒仅可作为泌尿生殖道衣原体感染的检测。(2)本试剂检测的是衣原体抗原，因而不能区别是衣原体的感染还是携带者。不能区别衣原体的死活，不能作为判愈试验。(3)本试验的敏感性为87%，特异性为98.8%。抗原检测免疫胶体金快速法检测临床应用 敏感性：较低 特异性:高 缺点：需要确证，不宜质控操作 临床应用：临床症状典型病例的检测不适合非典型感染的筛查抗原检测沙眼衣原体酶免疫法检测临床应用 敏感性：较高 特异性:高 缺点：需要确证，批量操作 临床应用：临床和健康体检沙眼衣原体感染的筛查三、核酸扩增试验（NAAT） 核酸扩增技术是通过扩增沙眼衣原体的多拷贝基因（如隐蔽性质粒、染色体和RNA）检测病原体。 方法包括：聚合酶链反应（PCR）连接酶链反应（LCR）等温链置换扩增技术（SDA）转录介导扩增技术（TMA）核酸序列扩增技术（NASBA）实时荧光PCR技术（目前采用较多的方法）NAAT法临床应用 敏感性：高（90%-97%） 特异性:高（99%-100%） 缺点：实验室条件和技术要求高，成本高，费时，假阳性，抑制物 临床应用：临床和健康体检沙眼衣原体感染的筛查。可用于宫颈、尿道标本以及尿液和阴道标本。四、细胞培养法： 原理：衣原体在瘤细胞生长，染色检测 方法：制备McCoy细胞接种标本（2500转，1h）去上清加新培养液（培养48－72）检测（碘或姬姆萨染色，荧光法）细胞培养法检测临床应用 敏感性：较低 特异性:极高 缺点：实验室条件和实验技术要求高，费时，敏感性低 临床应用：“金”方法方法学沙眼衣原体感染的确证沙眼衣原体感染的科研沙眼衣原体检测方法的选择： 临床典型沙眼衣原体感染，快速法 70％女性/50%男性无症状，ELISA或核酸检测 可疑病例确证：DFA，核酸检测，培养法 复发性感染：再感染：同上 持续性感染：基因检测分型小结 绝大多数感染无症状，每年10%比例增加 实验室诊断是临床诊断的唯一标准 合理选择实验室方法，合理解释结果 谢谢！