胰岛素抵抗细胞模型概

世界中西医结合杂志2012年第7卷第10期WorldJournalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine2012，Vol.7，No.10·综述·基金项目:国家自然科学基金资助项目(No．81172986)作者单位:1．湖北中医药大学，武汉430065;2．第二炮兵总医院，北京100088通讯作者:刘丽宏，Email:hongllh@yahoo．com．cn胰岛素抵抗细胞模型概况路敏1吕亚丽2刘丽宏2【关键词】糖尿病;细胞模型;筛药;综述【中图分类号】R587【文献标识码】A【文章编号】1673－6613(2012)10－0909－03糖尿病是世界范围的最常见的流行性疾病之一，其病死率在发达国家仅次于心血管疾病、恶性肿瘤，成为第三位致死疾病。糖尿病是由于胰岛素在体内的绝对或相对不足而引起的糖、脂肪及蛋白质代谢紊乱的疾病，主要分为胰岛素依赖型糖尿病(Ⅰ型即DIDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(Ⅱ型即NIDDM)，其中Ⅱ型约占90%以上［1］。Ⅰ型糖尿病主要是胰岛B细胞的损伤导致胰岛素分泌不足引起。Ⅱ型糖尿病胰岛素分泌正常甚至超过正常量，但机体对其不敏感即产生了胰岛素抵抗。目前关于降糖药物的筛选以及药物降糖作用机制研究，国内外普遍采用动物模型。动物模型的优点是可以从整体水平上直观地反映出药物的治疗作用、不良反应以及毒性作用，但也存在着诸多问题。比如试验周期长，试验费用高，不能快速检测药物的药效。体外细胞模型可以弥补动物实验的缺点，在探索新药和新化合物的药效方面具有快速、简便、节约的优势。本文现今国内外的一些体外降糖细胞模型，可以为降糖药物的筛选和机制的研究提供一个快速简便的工具。一、胰岛素抵抗的细胞模型的建立建立胰岛素抵抗细胞模型，从细胞模型上和验证一些药物的作用机制，启迪新型药物的发现和研究。1．HepG2细胞模型:HepG2细胞来源于肝细胞，系一种表型与肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株。它既保留了肝细胞的许多生物学特性，具有肝细胞的代谢特点，又便于体外培养，且具有胰岛素受体和受体后功能缺陷，故是胰岛素抵抗的理想细胞模型［2］。HepG2细胞株在高水平的胰岛素条件下，该细胞表面胰岛素受体的数目下降，其程度与胰岛素水平及刺激持续的时间呈正相关［3］。有人［4］将HepG2细胞置10－7mol·L－1胰岛素培养液中24h，使HepG2细胞胰岛素受体充分下调，后采用14C－葡萄糖、14C－醋酸盐掺合量、125I－胰岛素结合率检测并比较下调和未下调的HepG2细胞糖脂类代谢水平来评价模型。刘晓海等报道［5］，在培养的HepG2细胞中加入5×10－7mol·L－1的胰岛素，孵育16h，通过测定细胞培养液中的葡萄糖的消耗量以及培养液中的甘油含量来评价HepG2细胞的胰岛素抵抗状态。亦有研究者使用5×10－6mol·L－1胰岛素分别诱导36和48h来建立胰岛素抵抗模型［6］。万学东等［7］则采用0．25mmol·L－1的软脂酸(FFA)诱导24h，使HepG2细胞产生胰岛素抵抗，并通过检测培养液葡萄糖浓度，细胞内糖原含量，磷酸烯醇式丙酮酸的活性以及胰岛素蛋白受体底物2的蛋白水平验证了该模型的成功［8］。李兰芳等［9］采用肿瘤坏死因子TNF－α(4ng·mL－1)处理对数生长期的HepG2细胞96h，然后加入10－9mol·L－1的胰岛素和25mmol·L－1葡萄糖，继续培养24h，后检测上清液的葡萄糖浓度来评价胰岛素抵抗水平。2．3T3－L1前脂肪细胞:3T3－L1前脂肪细胞株，是一种从Swiss3T3－L1小鼠19d的胚胎中分离克隆获得的具有脂肪细胞分化潜力的细胞株，该细胞株在体外经诱导后可分化为成熟的脂肪细胞。目前，3T3－L1前脂肪细胞用于降糖实验有两种方法:一种是用药物直接用于3T3－L1前脂肪细胞，观察对细胞的增值、分化来探讨药物的降糖机制。佟晓哲［10］通过研究中药复方益糖康对3T3－L1前脂肪细胞分化的影响来探讨中药复方益糖康对糖尿病起作用的机理。王鸿［11］研究小檗碱对3T3－L1前脂肪细胞的增殖和分化实验中，得出小檗碱促进3T3－L1前脂肪细胞的增值，抑制其分化，能够减少脂肪的堆积，从而减少了脂肪堆积造成的胰岛素抵抗，推测这可能是小檗碱的降糖作用的一个理·909·DOI:10.13935/j.cnki.sjzx.2012.10.030世界中西医结合杂志2012年第7卷第10期WorldJournalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine2012，Vol.7，No.10论依据。另外一种是通过诱导3T3－L1前脂肪细胞，使其分化为脂肪细胞，再用诱导剂使其产生胰岛素抵抗。3T3－L1前脂肪细胞在诱导分化前首先要达到接触抑制，使细胞退出细胞周期而处于G0期才能诱导分化。目前比较公认的诱导方法为鸡尾酒诱导法［12］，即使用IBMX+DEX+INSULIN诱导前脂肪细胞变为脂肪细胞。刘慧霞［13］采用高浓度(10、15和25mmol·L－1)的葡萄糖对3T3－L1脂肪细胞进行诱导使其产生胰岛素抵抗。也有文献报道［14］，用金属铬诱导3T3－L1前脂肪细胞产生胰岛素抵抗，因为铬是ROS的诱导剂，ROS和胰岛素抵抗之间也存在着紧密联系。结果表明，铬(VI)治疗确实能显著抑制胰岛素刺激的葡萄糖摄取和促使胰岛素信号衰减。另外也有研究者采用游离脂肪酸来诱导3T3－L1细胞来建立胰岛素抵抗模型［15－16］。亦有采用地塞米松［17］、高胰岛素［18－19］以及肿瘤坏死因子［20］来诱导3T3－L1脂肪细胞来产生胰岛素抵抗。王火权［21］采用诱导的3T3－L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型然后对新和成的1，3－二羰基衍生物进行了胰岛素增敏活性药物的筛选。汤磊等［22］合成了13个苯并吡喃类化合物，用3T3－L1细胞模型对这些化合物进行了促脂肪细胞分化活性筛选及甘油三酯及蛋白测定，并用db糖尿病小鼠模型进行了降糖活性研究。3．原代肝细胞模型:肝细胞培养能较好反映体内代谢情况，它具有许多独特的优点，如:可同时获得大量性状较均一的样本;便于人为控制孵温或培养条件;能够排除许多复杂因素的干扰;基本上保留了肝脏原有的代谢功能和细胞分化状态、存活时间长等特点［23］。采用高浓度胰岛素诱导培养大鼠原代肝细胞胰岛素抵抗模型，将取下的肝脏移至培养皿中(含胶原酶)，得到大鼠原代肝细胞，然后用高浓度的浓度5×10－7胰岛素诱导。可采用免疫印迹技术和逆转录聚合酶链反应(PT－PCR)技术检测IR细胞模型的IDE酶蛋白表达(EIP)及基因表达水平(EIG)，同时检测IDE活性和反映细胞胰岛素敏感性的14C－2－脱氧葡萄糖掺入率及14C－醋酸盐掺入率评价该细胞模型的胰岛素抵抗性［24］。也有文献报道［25］，采用两步灌流液分离大鼠肝细胞，即无菌状态下，先用灌流液开放灌注10min，再使用胶原溶液以相同速度进行循环灌流10min，剪碎肝脏水浴摇床20min后，台盼蓝染色确定肝细胞存活率，后采用高浓度葡萄糖刺激法，用含25mmol·L－1葡萄糖的培养基培养SD大鼠原代肝细胞，连续24h，造模过程中利用MTT法检测细胞OD值来反应肝细胞活性，通过细胞培养液上清液的葡萄糖的浓度变化来反映肝细胞对糖的摄取能力。也有报道［26－27］，采用不同浓度的脂联素处理体外培养的大鼠肝脏细胞，从能量代谢角度去探讨胰岛素抵抗的作用机制，检测肝脏糖来了解糖代谢途径的变化。不过目前国内用原代的肝细胞研究糖尿病的报道还比较少，有待于原代肝细胞模型的进一步探索。4．L6大鼠肌细胞:L6细胞是大鼠成肌细胞，是骨骼肌发育分化研究中常用的细胞模型，也是目前比较常用的胰岛素抵抗的骨骼肌细胞。杨亮等［28］通过对L6细胞株进行诱导分化培养培养出成熟的具有肌管结构的L6细胞株，用无血清的培养基饥饿培养5h，再用1×10－7mol·L－1胰岛素刺激来建立骨骼肌胰岛素抵抗模型。经考马斯亮蓝对诱导后的细胞骨架染色，以及对培养液上清液的葡萄糖浓度测定，证明建立了胰岛素抵抗的骨骼肌模型。5．诱导的多能干细胞(IPS):IPS细胞是最近四五年研究最热，具有极大的发展空间和潜力的细胞，它具有胚胎干细胞的诸多功能，可以分化为各种类型的细胞，器官和组织。直接从患者皮肤或是血液中获得，通过诱导可以分化出想要的任何组织器官细胞病理模型，且该细胞可以无限分裂，不易出现细胞疲软状态。现已有报道［29－30］，已经分化出胰岛素B细胞，可以用于糖尿病细胞模型的筛药研究。根据Ips细胞的特点，该细胞模型亦可用于基因型病变造成的糖尿病的药物筛选，以及胰岛素类似剂药物的筛选。二、展望本文总结了目前国内外关于糖尿病胰岛素抵抗的经典细胞模型，如HepG2细胞，3T3－L1前脂肪细胞，L6大鼠肌细胞，原代肝细是胰岛素作用的靶细胞，这些细胞能很好的反映出关于胰岛素的生理和病理状态，是研究胰岛素抵抗机理很好的体外细胞模型。本文提到的诱导的多能干细胞(IPS)则具有分化为各种组织的能力，能够模拟体内真实的环境，所以使得研究数据更具有真实性。研究者可根据不同的研究目的和实验条件选择合适的细胞模型。参考文献［1］徐铭恩．Ⅱ型糖尿病/代谢综合征药物筛选及机制研究［D］．杭州:浙江大学生物医学工程与仪器科学学院，2005．［2］陈秋，夏永鹏．胰岛素耐受的HepG2细胞模型建立［J］．细胞生物·019·世界中西医结合杂志2012年第7卷第10期WorldJournalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine2012，Vol.7，No.10学杂志，2005，27(3):334－338．［3］WilliamsJF，OlefskyJM．Defectiveinsulinreceptorfunctionindown－regulatedHepG2cells［J］．Endocrinology，1990，127(4):1706－1717．［4］李长贵，宁光．胰岛素抵抗HepG2细胞模型的建立及鉴定［J］．中国糖尿病杂志，1999，7(4):198－200．［5］刘晓海，董志，傅洁民，等．倍他福林对胰岛素抵抗HepG2细胞模型的作用及其初步机制［J］．中国新药杂志，2008，17(12):1026－1029．［6］孙静，易娟，陈静，等．胰岛素抵抗的人肝癌细胞HepG2对多柔比星的敏感性［J］．肿瘤，2009，29(11):1036－1039．［7］万学东，王希明，夏炎枝，等．游离脂肪酸引起肝细胞胰岛素抵抗及其机制的研究［J］．上海医学，2005，28(1):965－967．［8］万学东，陈宝生，夏炎枝，等．PKC在软脂酸诱导的肝细胞胰岛素抵抗信号转导中的作用［J］．中国老年学杂志，2008，28(1):115－116．［9］李兰芳，黄秀清，原慧萍，等．吡格列酮改善胰岛素抵抗下氧化应激水平机制探讨［J］．中国临床药理学与治疗学，2008，14(3):245－249．［10］佟晓哲．中药复方益糖康对3T3－L1前脂肪细胞分化过程中凋亡的影响［J］．中华中医药学刊，2010，28(5):1013－1015．［11］王鸿．小鼠3T3－L1的培养、鉴定及小檗碱对其增殖分化的影响［D］．太原:山西医科大学，2004．［12］郑梅琴．抗糖尿病化合物筛选模型的建立和应用［D］．沈阳:沈阳药科大学，2006．［13］刘慧霞．3T3－L1脂肪细胞中高糖诱导胰岛素抵抗的分子机制［J］．湖南医科大学学报，2001，26(4):294－296．［14］GeX，LiuZ，QiW，etal．Chromium(VI)inducesinsulinresistancein3T3－L1adipocytesthroughelevatedreactiveoxygenspeciesgeneration［J］．FreeRadicRes，2008，42(6):554－563．［15］易屏，陆付耳．小檗碱改善3T3－L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机制［J］．中华内分泌代谢杂志，2007，23(4):346－350．［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