精液的冷冻保存

精液的冷冻保存主讲人：朱秀生一、实验目的：练习公猪、公牛精液冷冻保存的方法，要求学会：1、稀释液和解冻液的配制方法；2、精液的稀释、降温、平衡及制冻的技术；3、冷冻精液的解冻技术。二、实验材料：公猪精液、公牛精液、新鲜牛奶、新鲜鸡蛋、葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠（二水）、蒸馏水、量筒、玻璃注射器、烧杯、三角烧瓶、滴管、冰壶、保温杯或小液氮罐或泡沫盒、冰、液氮、0.25mL塑料吸管、冷冻架、温度计、水盆、纱布、棉花，抹镜纸、75%精棉球、镊子、捞筛、液氮罐、载玻片、小玻棒、石腊油、显微镜、水浴锅、铝锅、电炉、标记笔等。精液冷冻保存原理精子在超低温下，其代谢活动几乎停止（完全被抑制），使其在静止状态下保存下来，一旦升温又能复苏而不失去受精能力。其理论依据是玻璃化假说和甘油保护学说。（1）玻璃化假说物质的存在形式有气态、液态和固态，其中固态又分为结晶态和玻璃态。在不同的温度条件下，这两种形式可以相互转化。A.结晶态当精液的温度由冰点（0℃）缓慢降到-60℃左右时，精液中的水分由液态变成固态，冰晶颗粒大而均匀，叫做结晶态或冰晶化。对细胞内的细胞器构成巨大的破坏作用，因而，把这一温度区称为有害温区。缓慢降温形成冰晶化是造成精子死亡的主要原因。B.玻璃态但在特定冷冻剂参与下，精液由低温骤然降到-60℃度以下，精液变成固态时，冰晶颗粒细小而均匀，叫做玻璃态（化）。不会对细胞器造成破坏，从而达到长期保存的目的。经试验证明，在0～60℃是冰晶形成的温度区域，叫做危险温度区。而且在逐渐降温的条件下才能形成。降温越慢，冰晶形成越大，尤以-15～25℃为甚。玻璃化必须在-60～-250℃的低温区域内，经快速降温，迅速越过冰晶化而形成。抗冻剂的抗冻原理甘油保护学说快速降温可使精液跨越结晶态进入玻璃态，但急剧降温会造成精子冷休克。研究明，向稀释液中添加甘油，不但可增强精子的抗冻能力，而且又可防止冰晶化和精子冷休克。甘油又名丙三醇，分子式CH2（OH）－CH2（OH）－CH2（OH），为高热能脂肪家族，其3个羟基（OH）为亲水基团，可与精液中的水结合，限制和干扰水分子的晶格排列，而产生冰晶；其烃链为疏水基团，朝向精子，可阻止精子的内外水分相互渗透，从而使精子保护在玻璃化膜中。但是，甘油浓度高时，对精子有危害作用，应掌握甘油的用量。一般牛冷冻精液中甘油通常加入5％～7％。除甘油外，其他多羟化合物如二甲基亚砜(DMSO)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、糖类等都具有抗冻作用。冷冻保存精液剂型塑料细管型颗粒型 安瓿型目前已很少采用。精液冷冻之后，因有半数以上的精子遭受冻害而死亡，故精液稀释液倍数，应按照解冻后需保证每头份精液中要求应含有直线前进运动的有效精子数来确定。为此，实际上应根据原精液呈直线前进运动的有效精子总数和冷冻精液解冻后预测精子活力来决定精液的稀释倍数，其计算公式如下：   X=Y·M·V/Z   式中：X为冷冻精液稀释倍数   Y为每ml原精液中呈直线前进运动总精子数   M为冷冻精液解冻后预测精子活力   Z为每头份冷冻精液要求最低应含有直线前进运动精子数   V为冷冻精液剂型容量   由于细管型冷冻精液的容量为0.25或0.5ml，因此稀释倍数较低。而颗粒型冷冻精液前后需经两次稀释(冷冻稀释和解冻稀释)，每头份剂量为1.5～2.0ml，因此稀释倍数也就较高。例如根据我国牛冷冻精液国家，细管型冷冻精液容量为0.25ml，直线前进运动精子数不低于1000万个；颗粒型冷冻精液容量为0.1ml，直线前进运动精子数不低于1200万个；解冻后的精子活率均不得低于0.3。因此，如0.25ml细管型冷冻精液的稀释倍数(X)应代入上述公式为：   X=直线前进运动精子数/ml*预测精子活率（≥0.3）*0.25ml/1000万三、方法与步骤（一）公猪精液的冷冻保存方法本次实验为精液的颗粒冷冻，制冻采用吊盆法。在液氮中（－196℃）保存。液氮是一种无色、无味、无臭、无毒的超低温液体，标准温度为－195.8℃。在气化时，每升可以从周围夺取200千焦(48千卡)热量，气化后温度上升至18℃时，体积膨胀680倍。此外，液氮为不活泼气体，其渗透性很弱，本身无杀菌能力，故精子、细菌、微生物等仍能在其中生存，只是－196℃的超低温可使多数细菌、病毒停止繁殖。 1、稀释液及解冻液的配制（1）稀释液的配制①用天秤分别称取葡萄糖4g、蔗糖1.2g，放入干净的烧杯中，然后加入蒸馏水57mL。搅拌混合均匀，加盖，置于水浴锅中隔水煮沸消毒10min，取出冷却备用。②将新鲜牛奶用3～4层纱布滤入干净烧杯。并加盖隔水煮沸消毒10min，取出冷却后，用消毒过的玻棒除去奶皮备用。③分别用消毒过的量筒量取葡萄糖、蔗糖液28.5mL、牛奶15mL和甘油1.5mL置于另一消毒过的烧杯中，然后再用消毒过的注射器吸取蛋黄5mL加入其中，反复抽打，使其混合均匀，便成稀释液。（2）解冻液的配制用天秤分别称取葡萄糖1.5g、柠檬酸钠（二水）0.75g置于干净的烧杯中，再加蒸馏水50mL，加盖隔水煮沸消毒10min，取出冷却后，加入安那咖注射液1ml便成解冻液。2、精液的稀释（1）将采得的精液检查其性状，包括颜色、混浊度、密度。活率及PH等顶目，并将结果记载于表中，要求活率达0.7以上的，始供稀释用。（2）将精液与稀释液同置于室温中10min，使二者的温度一致，便按1：l的比例分别量取所需量置于消毒过的三角烧瓶中，轻轻混合均匀，镜检精子活率。3、降温平衡将稀释好的精液放在装有冷水的烧杯中，再移入维持7℃的冰壶里平衡30～60min，然后镜检精子的活率，要求活率不低于0.6，始供制冻。4、制冻（1）将保温杯或冰壶用小量液氮预冷2min，然后装入液氮约7成满，并将制冻用的吊盆平稳地固定于离液氮面约1～1.5cm处，加盖预冷2min。（2）揭开壶盖，用滴管吸取平衡过的稀释精液，迅速滴在吊盆的凹槽内，每滴约lmL。滴完，加盖l～2min，然后揭开壶盖，当精液完全冻结，并发出“喳喳”声时，即可铲脱并倒入液氮内进行冷冻保存。5、解冻（1）湿解冻①将消毒过的小烧杯加入解冻液1mL放在56℃水浴锅进行预热。②由液氮中取出1颗冷冻精液放入预热过的解冻液内并旋转摇动之，待冻精刚好解冻即提出水浴，镜检精子活率，并将结果记入表中。（2）干解冻由液氮中取出1颗冷冻精液放入小烧杯中，立即放入56℃水浴锅中旋转摇动，待冻精刚好解冻即提出水浴，加入1mL解冻液（如果室温低于25℃，解冻液需要稍预热）并旋转摇动，之后立即镜检精子活率，将结果记入表中。日期气温畜别公畜号数射精量颜色混浊度密度PH值原精液活率稀释后活率冻前活率解冻后活率精子复苏率备注四、作业1、将本次实验结果记入下表。2、为了提高解冻后的精子活率（即复苏率），你认为应注意哪些事顶？3、在此次实习中，你认为在操作过程中存在着什么问题，应如何改进？谢谢大家THANKYOUFORYOUR