慢性乙型肝炎患者外周血中乙肝病毒表面抗原低水平发生机制

慢性乙型肝炎患者外周血中乙肝病毒面抗原低水平发生机制的研究郭红英张继明李新艳毛日成翁心华复旦大学附属华山医院传染病科，华山医院肝病中心200040[摘要]目的　慢性乙型肝炎患者外周血中乙型肝炎病毒（HBV）的表面抗原（HBsAg）滴度通常较高，长期临床观察发现少部分慢性乙型肝炎患者病毒滴度低于250国际单位每毫升(IU/ml)，本文探讨此类患者外周血中乙肝病毒表面抗原低水平的发生机制。方法　HBsAg滴度以美国雅培公司ARCHITECTi2000SR仪器检测值为，收集低于250IU/ml患者的血清，抽提血清中的HBV-DNA,并对HBV　S区进行PCR扩增及测序。对于出现特殊变异位点的血清标本，进行全基因扩增并测序，从而得到血清HBV全基因序列。将每例标本的全基因扩增产物进行克隆，从中随机挑选15-20个单克隆，对每个单克隆的S区进行测序及序列分析，将单克隆S区序列与血清HBV全基因序列进行比对，挑选出与血清HBV全基因序列同源性最高的克隆，即优势株。将挑选出优势株的小S蛋白（S-HBsAg）基因克隆至pXF3H真核表达载体，在S-HBsAg的氨基端加入HA标签蛋白。将该表达载体转染至Huh7及Hela细胞内，用ARCHITECTHBsAgQT方法检测上清中的HBsAg。用针对HA的抗体进行免疫印迹实验，来检测含HA标签蛋白的HBsAg表达量。结果　分析16例低表面抗原水平患者的S区氨基酸发先有15例患者发生了某些位点变异,其中报道较多的位点有：T120T，T/I126N，Q129N，G130R，T131N，M133T。报道较少的位点为：N40S，I68T，C76Y，L95W，V96G，L98V，S117T，A157D，W196L，F220L。发现S6号患者S-HBsAg区的启动子（nt2976-3174）缺失，其15个亚克隆此区域均缺失。S15号患者S-HBsAg第22位氨基酸出现终止密码子，分析其9个亚克隆的S-HBsAg氨基酸发现有3个第22位氨基酸出现终止密码子，3个第31位氨基酸出现终止密码子，3个氨基酸序列与野毒株完全相同。分析其亚克隆的氨基酸序列发现：一些亚克隆出现了一些优势株未出现的影响HBsAg抗原性的变异位点。如：K122R，S132F，F134L，P142H，C149R；另外一些影响分泌的变异位点：C48Y，L77Q，R78Q，R79H，C107R的变异及69位半胱氨酸的缺失。将S6号（含有Q129/N变异位点）和S2号（含有T/I126N及T131N变异位点）的优势株小S基因的PXF3H质粒转染细胞后，上清中HBsAg的水平较野毒株水平低2-4倍，但上清中用针对HA抗体进行免疫印迹实验检测，发现含HA蛋白标签的变异株(mtHBsAg)的表达量较野毒株（wtHBsAg）增加，其糖基化的S-HBsAg的量更是明显增多。同样抗体免疫印迹实验检测细胞裂解液中含HA蛋白标签的S-HBsAg表达量具有同样发现。mtHBsAg用针对S-HBsAg多克隆抗体进行免疫印迹实验，结果为阴性。结论小S区氨基酸某些位点的变异（优势株和非优势株）是慢性乙型肝炎患者外周血中乙型肝炎病毒低表面抗原水平的因素之一，小S基因的启动子缺失和S区氨基酸在抗原表位前已经出现终止密码子也是因素之一。另外某些小S区的氨基酸位点变异为天门冬酰胺（asparagine，即N）后，其糖基化的S-HBsAg水平即升高，S-HBsAg过度糖基化将影响其空间构型进而影响其抗原性，影响了其检测水平。总之，多种因素导致了某些慢性乙型肝炎患者外周血中低HBsAg的水平。[关键词]]乙型肝炎病毒；低表面抗原水平；全基因扩增；转染，免疫印迹作者单位：200040，复旦大学附属华山医院传染科（郭红英、李新艳、张继明、毛日成、翁心华）；通讯作者：张继明，E-mail:jmzhang@fudan.edu.cnThemechanismoflowHBsAgtiterinchronichepatitisBpatientsGUOHong-ying,ZHANGJi-Ming*,etal.DepartmentofInfectiousDiseases,HuashanHospital,FudanUniversity;Shanghai;200040,China*correspondenceauthor:ZHANGJi-Ming,email:jmzhang@fudan.edu.cnObjective：ToinvestigatethemechanismoflowtitersofHepatitisBsurfaceantigen(HBsAg)inchronichepatitisBpatientswhopossessinghighHBV-DNAlevelinthisstudy.Methods:HepatitisBvirus(HBV)DNAwasextractedfromseraofsixteenchronichepatitisB(CHB)patientswithoutantiviraltherapies,whowereexperiencinglowtitersofHBsAgaswellashighHBV-DNAlevels.TheseHBV-DNAsampelswereamplifiedthensequencedtoidentifythedominantmutationpatternswithintheSgene.From5representativeserumsamplesthatpossessmutationsintheSgene,full-lengthHBVgenomeswereclonedintopUC19vectorsandsequenced.TheSgenesharboringQ129NorT126N/T131NmutationswerefurtherclonedintopXF3HvectorswithHAtagsattheN-termini.TheseHAtaggedHBsAgmutants(mtHBsAg)werethentransfectedintoHuh7celllines,anddetectedbyWesternblotusingpolyclonalrabbitanti-HAAntibodies.Meanwhile,thereactivityofwild-typeHBsAg(wtHBsAg)andmtHBsAginsupernatantswasmeasuredusingtheARCHITECTHBsAgassaykit(Abbott).Results:Basedonanalysisofthesurfacegene(Sgene)sequences,samplesfrom15outof16patientsenrolledinthisstudyhavepointmutationsintheSgene,resultinginaminoacidchanges.ThesemutationsincludesomeprevalencesitessuchasT120T,T/I126N,Q129N,G130R,T131NandM133T.Furthermore,somemutationswererarelyobservedinpreviousstudies,includingL95W,V96G,L98V,S117TandA157D.Noneofthecaseshadanaminoacidsubstitutionofcodon145oftheSgenethatisreportedtoberesponsibleforweakrecognitionbytheHBsantibody.OnedeletioninthepreS2/Spromoterregionwasfoundinfiverepresentativefull-lengthHBVgenomes.Inanothercase,threeoutofninecloneshavepointmutation,whichconvertsLeu-22tostopcodon,andtheotherthreeclonesareterminatedatthe31stpositionoftheSgenes.SequencingoftheSgenesoffull-lengthHBVgenomesrevealedseveralpointmutationswithintheSgenewhichwerenotfoundinthedominantstrains，suchasK122R,S132F,F134L,P142HandC149R,whichmayinfluencetheantigenicityofHBsAgorreduceyieldsofthesecretedparticles,includingC48Y,L77Q,R78Q,R79H,C107RandC69deletion.TheexpressionlevelofmtHBsAginsupernatantswasthreetimeslowerthanthatofwtHBsAg,whereasthetotalexpressionlevelofmtHBsAgincelllysatesdetectedbyanti-HAantibodiesbyWesternblotwasmuchhigherthanthatofwtHBsAg.Moreover,theglycosylationofmtHBsAgwashigherthanthatofwtHBsAg,andabolishedthereactivitytopolyclonalanti-HBs.Conclusion:ThemutationsintheSgenecontributetothelowtiterofHBsAginCHB,andthepreS2/SpromoterdeletionandstopcodonsbeforemajorhydrophilicregioninSgenealsoareresponsibleforescapeofHBVs.HBVvariantswithsubstitutionatposition129(GlytoAsn),126(IletoAsn)and131(ThrtoAsn)increasethelevelofHBsAgglycosylation,whichmayinterferewiththeantigenicityofHBsAg.variousfactorsresultinthelowtitersofHBsAginCHB[Keywords]HepatitisBvirus;lowtiters;transfection;Westernblot乙型肝炎病毒（HBV）感染是引起世界性的地方流行性疾病，其感染极大了增加了世界性主要的恶性肿瘤原发性肝癌的发生率。HBV属嗜肝DNA病毒科，是带有衣壳的嗜肝细胞病毒。其衣壳蛋白（HBsAg）根据分子量的大小分为三种：大，中，小蛋白及其它们的糖基化的衍生物，比例大约为2/1/7[1]。其中小蛋白（S-HBsAg）是病毒粒子外壳的主要组成蛋白，在感染细胞内高水平表达，并且具有自我聚合成空S-HBsAg组成的亚病毒颗粒（SVPs），没有核苷酸的参与[2]。一般是以由100个HBsAg单体组成的22-nm的球形粒子出现于HBV感染者的外周血中[3]。HBsAg是HBV感染的标志物，最新研究显示：血清中HBsAg的水平和cccDNA和肝细胞内HBV-DNA水平有很好的相关性，治疗前低HBsAg水平比低HBV-DNA能更好的预测患者对长效干扰素和拉米夫定的有较好的反应。所以，血清中HBsAg定量检测有望成为cccDNA和肝细胞内HBV-DNA水平替代指标[4]。材料和方法1.病例选择入选对象为2008年3月～2009年3月在我院就诊慢性乙型肝炎患者，除符合我国于2005年发布的“慢性乙肝防治指南”中有关慢性乙型肝炎的诊断标准。入选标准包括：（1）未经过抗病毒治疗慢性乙型肝炎患者（2）用ABBOTT试剂盒定量试剂检测HBsAg滴度小于250IU/ml（3）HBV-DNA大于1X104copies/ml。对照组为年龄，性别，HBeAg状态，病毒滴度与之匹配的慢性乙型肝炎患者。样本组与对照组的比例为1：1。随机组为我院连续三天检测HBV-DNA大于1×104copies/ml患者，样本组与随机组的比例为1：3。2.质粒质粒载体PXF3H为德国陆蒙吉教授馈赠，该质粒从PRK5质粒改造得来，为真核表达载体，上游包括CMV启动子，HBsAg基因是用EcoRI和PstI酶切克隆到载体上，HA标签蛋白连在HBsAg的N端。同时还馈赠分别含野毒株S区和T123N变异的S区的PXF3H质粒。3.细胞系人肝癌细胞系Huh7保存于液氮中，复苏后培养于含10%的胎牛血清，2mM的谷氨酰胺，100U/ml的青霉素及100ug/ml链霉素DMEM培养液中。4.HBsAg滴度测定将收集的与低表面抗原相匹配的对照组的标本，同样以ABBOTT定量试剂及稀释液测定滴度。5.序列分析用酚，氯仿方法抽提收集的患者血清HBV-DNA,进行HBVS区PCR扩增及测序分析,将出现特殊变异位点的6例病例，按照Gunther的方法[5]，进行HBV全基因扩增和测序，测序引物见表1。HBV全基因扩增产物经胶回收后，用SacI酶切，回收酶切产物。PUC19载体同样用SacI酶切，经5’末端去磷酸化处理后再次胶回收。载体与目的片段连接后转至DH5a感受态细胞。挑单克隆15-20个，摇菌后抽提质粒，经SacI酶切鉴定阳性克隆。阳性克隆用S区的引物S1,AS（见表1）测序，挑选优势株及分析S区变异情况。6.含HBsAg基因的PXF3H质粒载体构建挑选出4例S区含特殊变异位点的标本，将其S区序列与血清HBV全基因序列进行比对，挑选出与血清HBV全基因序列同源性最高的克隆（即优势株）。将抽提的质粒进行浓度测定，稀释一定比例作为模版。1例以引物SP1,SP2（见表1），其余3例以引物SP3,SP4（见表1）进行PCR，将PCR产物胶回收纯化，纯化产物进行EcoRI和PstI双酶切，同样将PXF3H载体用EcoRI和PstI双酶切。分别作为目的片段和载体，将目的片段和PXF3H载体按一定比例混合，于16℃用T4连接酶连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，用EcoRI和PstI双酶切对克隆进行初步鉴定，再用DNA测序方法进行确认（采用引物SP1）。7.包含不同变异位点S区基因的PXF3H质粒转染Huh7及Hela细胞将Huh7及Hela细胞培养在含10%的胎牛血清的适合的培养基内，接种于6孔培养板，5×105/孔，培养在37°C和5%CO2孵箱中，待细胞约60至80%融合成片时，用脂质体lipofectamine2000将构建好的PXF3H质粒转染Huh7细胞，每种质粒每孔4ug。为检测转染效率，同时转染两孔GFP，荧光显微镜下观察转染效率，Huh7细胞转染效率50%-60%，Hela细胞转染效率为80%-90%。同时将陆蒙吉教授馈赠的WT及T123N质粒同时转染作为对照。Huh及Hela细胞培养48h后，将上清于转染后48h收至1.5ml的EP管中，细胞用预冷的PBS洗三次，以0.25%的胰蛋白酶消化，用PBS吹打细胞收EP管，离心后弃上清，加细胞裂解液处理，离心后取上清，蛋白定量。用ARCHITECTHBsAgassaykit检测上清中HBsAg表达量依据生产商的说明的操作步骤。8.免疫印迹实验检测细胞内HBsAg的表达量将细胞裂解液和其两倍浓度的蛋白缓冲液混合，为凝胶电泳预热10分钟，50ug的蛋白加至凝胶孔中，跑电泳后，蛋白将转至硝化纤维素膜上，用针对HA标签蛋白的兔子的多克隆抗体（1：300）稀释和标记HRP的来自羊的针对兔子的二抗（1：5000）稀释来检测含HA标签蛋白的HBsAg（来自SantaCruz公司）。同时用马来源的针对小S蛋白的多克隆抗体（1：500）稀释及其标记HRP的来自兔子的针对马的二抗（1：2000）稀释检测mtHBsAg抗原性有无改变（购于Abcam公司）。9.免疫沉淀（IP）后，用免疫印迹实验检测上清中的含HA标签蛋白的HBsAg取700μl细胞转染后的上清液，加入10μl针对HA标签蛋白的兔子的多克隆抗体（来自SantaCruz公司），将13ulproteinG加入后4℃孵育过夜，免疫沉淀反应后，在4°C以3,000g速度离心5min，将proteinG离心至管底；将上清小心吸去，用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入30μ的1XPLB，50℃煮20min。用鼠源性的针对HA标签蛋白的一抗（1：10000）稀释及其二抗检测上清中的含HA标签蛋白的HBsAg。结果1.病例资料分析共有16例低表面抗原的患者入组，其中男性14例，女性2例。年龄在25-76岁之间，（平均为45.8）。其中HBeAg阳性的患者11例，阴性为5例，其中HBsAg和HBsAb同时阳性的患者为5例。S区测序表明，基因B和C型各8例，血清型adw11例，adr5例（见表2）。对照组为年龄，性别，HBeAg状态，病毒滴度与样本组匹配的患者，故两组年龄，病毒滴度均无明显差别，但其HBsAg的滴度却相差显著，病例组滴度平均值119.78IU/ml,对照组为26152.33IU/ml（见图1）。从样本组与随机组分析表明，低表面抗原的患者平均年龄偏大，HBeAg的滴度及HBV-DNA水平偏低（数据未列出）。2.低表面抗原的测序序列分析2.1S区氨基酸变异位点分析16例低滴度的患者S区氨基酸发现15例患者S区氨基酸发生了变异,其中报道较多的位点有：P120T,T/I126N,Q129/N,G130/R,T131N,M133T。少有报道的位点为：N40S,I68T,C76Y,L95W,V96G,L98V,S117T,A157D,W196L，F220L（见表3）。为分析这些位点变异的意义，将16例样本的S区的变异频率与200例高表面抗原病例的S区变异的频率进行比较，具有显著差异（见图2）。四例进行了亚克隆的S区序列分析（见表4），每例患者的亚克隆均有多种变异情况，对四例病例的亚克隆的S区进行分析，某些优势株未出现的影响抗原性的变异位点，如：K122R，S132F，F134L，P142H，C149R，亚克隆中却有出现。此次入组的病例中其亚克隆出现了C48Y，L77Q，R78Q，R79H，C107R的变异及69的半胱氨酸缺失。2.2S启动子序列缺失序列分析其中一例患者，女性，45岁，HBeAg阳性。S区启动子即PreS1区（nt2976-3174）缺失。其14个亚克隆在此区均出现缺失（见表3）。2.3S区终止密码子分析其中一例患者男性，76岁，HBsAg和HBsAb同时阳性，HBV-DNA为2.54×106copies/ml。测序S区发现其第22位氨基酸出现终止密码子，进行全基因扩增和克隆后，分析其9例亚克隆的S区的序列：3个第22位氨基酸出现终止密码子，3个第31位氨基酸出现终止密码子，3个没有出现终止密码子且其序列和野毒株完全一致。3.转染后细胞表达的HBsAg的检测结果3.1转染后上清液中用ARCHITECTHBsAgassaykit检测的HBsAg水平，含有Q129N，Q/126N及T131N变异的mtHBsAg较wtHBsAg低2-3倍（见图3）。上清液用针对HA标签蛋白的抗体做免疫沉淀后，检测含HA的HBsAg量此变异株比野毒株明显高2-3倍，且其糖基化HBsAg的量比野毒株明显增多（见图5）。3.2细胞裂解液内用针对HA标签蛋白的抗体免疫印迹实验检测HBsAg同样发现，含有Q129N，Q/126N及T131N的mtHBsAg明显比wtHBsAg增多，且其糖基化HBsAg比例比野毒株明显增高。用针对小S蛋白的多克隆抗体mtHBsAg检测不到（见图4）。讨论Carman等报道了44位HBV感染的母亲及其孩子，尽管这些婴儿都按标准方法进行了主动及被动免疫，但仍有32位婴儿感染乙肝病毒，其中G145R就是从其中一个婴儿血中分离的，此变异株十分稳定，在五年后仍可分离[6]，此为公认的且最流行的疫苗和免疫球蛋白的压力下产生的变异。相继又报道了很多S区的变异位点，如124，126，129，131，133，137，140，142，144[7-9]。夏国梁等对我国接种乙肝疫苗后仍然感染HBV的儿童进行研究发现“a”抗原决定簇的氨基酸变异率达到31%，突变最多的位点为145，126，133。除了疫苗相关性HBsAg的变异之外，在肝脏移植后用单克隆表面抗体进行治疗性实验的患者[10]及并没有接收免疫球蛋白和疫苗的携带者中[11]及其它抗病毒治疗的慢性乙肝病毒携带者中[12]也发现了HBsAg基因的变异。与此报道相一致的研究发现，S区的某些变异位点并非出现在“a”抗原决定簇内（S区氨基酸139位至147位），应用疫苗和高水平的免疫球蛋白后产生的变异常出现在这个区域。这就暗示着也许它们是自然产生的，并非是免疫中和逃逸的变异株。它们医学上意义可能只和诊断试剂的有效性有关[9]。此次入选的患者中均未进行疫苗免疫和免疫球蛋白的治疗，测序S区发现出现了很多变异位点，T120T,T/I126N,Q129/N,G130/R,T131N,M133T，这些变异位点均位于“a”抗原决定簇，曾有较多文献报道过126，129位点变异将影响其抗原性，I/T126A/S/N，Q129R/H/L/N也曾报道过[8,13-16]。T131N,M133T曾发现出现于HBsAg阴性的患者中[17-19]。L95W,V96G,L98V,S117T，T120T，G130/RA157D则少有报道。A157D则是少有报道的一个变异位点，曾有研究发现在基因D型中出现A157R的变异，但此变异用多克隆抗体和ARCHITECTHBsAgQT仍可以检测到[20]。目前研究就发现一些变异是自然产生的，并非是免疫中和逃逸的变异株，这样的变异常出现于“a”抗原决定簇以外，但影响现有试剂盒对HBsAg检测的有效性[9]。此次入组的病例中，“a”抗原决定簇以外出现的变异或许就属于此种类型。研究发现S区某些变异位点可以影响病毒粒子及亚病毒颗粒的分泌，报道较多的是G145R，L77R，R78K，R79K，G119E，M133T，R169P[21-23]，此次入组的病例中有两例其优势株发生了M133T的变异，此种变异影响了病毒粒子及亚病毒颗粒的分泌，进而导致了血清中表面抗原的检测明显下降。对四例病例的亚克隆的S区进行分析，某些优势株未出现的影响抗原性的变异位点，如：K122R，S132F，F134L，P142H，C149R，亚克隆中却有出现。有报道L77Q，R78Q，R79H的变异将影响了其SVPs的分泌[21,24,25]，此次入组的病例中其亚克隆出现了L77Q，R78Q，R79H的变异，这或许影响了其分泌进而影响了HBsAg的滴度。研究发现：一些氨基酸的替换将影响病毒粒子的分泌水平，其大部分位于S-HBsAg的氨基末端或者抗原性的环内。通过变异分析，位于48，65，69和107位的半胱氨酸残基对于SVPs的分泌是至关重要的[26]。一例患者中发现69的半胱氨酸缺失及C107R的变异，另一例则出现C48Y的变异，这又会影响其分泌。曾有报道S区启动子（及前S1区）的缺失将影响HBsAg的分泌[27,28]，原因或许是SP1转录元件的结合位点的缺失导致小蛋白转录产物量的减少，进而大蛋白和小蛋白比例的改变影响HBsAg的分泌[29]。此次入组的低表面抗原的患者中一例S区启动子缺失，其在影响转录产量的同时还影响HBsAg的分泌，故导致了低表面抗原。此次入组的低表面抗原的患者一例在S区的第22位氨基酸出现终止密码子，其亚克隆约1/3的克隆第22位氨基酸出现终止密码子，1/3的克隆第31位氨基酸出现终止密码子。1/3克隆序列与野毒株完全一致。这也许就是此例患者血清中表面抗原明显下降，却仍然可以检测到的原因。体外转染实验表明，含T123N,Q129N,T126N及T131N,三种变异位点类型的质粒，在转染质粒相同，内参平的情况下，表达的S-HBsAg比野毒株明显增加，这是否由于某些位点的变异导致其mRNA空间结构的改变进而翻译明显增加，需要进一步的研究。与野毒株相比，其糖基化的S-HBsAg明显增加，这与其变异的氨基酸是相符合的，天门冬氨酸（即N）与糖基化相关的一种氨基酸。糖基化影响HBsAg空间构型，进而影响其与抗体结合能力，改变其抗原性。由于上清中和细胞裂解液用针对HA的抗体检测，变异株的表达量均明显较野毒株增加，故很难证明其变异是否影响HBsAg的分泌。此次入组的病例中5例为HBsAg/HBsAb同时存在的患者，5例为HBeAg阴性的患者，此部分病例产生的变异可能长期在宿主的压力下产生。其余为HBeAg阳性的患者的变异可能为自然发生的变异。另外部分病例既无明显的变异，也未发现启动子的缺失，应该还存在其它影响表面抗原滴度的原因存在。总而言之，多种因素导致了某些患者血清中低表明抗原。参考文献1. 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