2.2.1动物细胞培养和核移植技术

2.2 动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段： 动物细胞培养技术、 动物细胞核移植技术、 动物细胞融合技术、 生产单克隆抗体技术 提问： 植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养技术、 植物体细胞杂交技术 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 2.2.1 动物细胞培养和核移植技术 一、动物细胞培养 概念:就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞，然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。 植物组织培养 在无菌和人工控制的条件下,将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工控制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。 一、动物细胞培养 选材： 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。 在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的pH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。 分散成单个细胞 一、动物细胞培养 细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 要求：培养瓶或培养皿的内面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 动物细胞生长特性： 动物机体组织 单个细胞 原代培养 稀释 分装 传代培养 培养过程： 原代培养 培养过程： 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 细胞悬浮液 胰蛋白酶 10代细胞 原代培养 传代培养 无限传代 单个细胞 加培养液 动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。 （分解弹性纤维） 动物细胞培养不能 最终培养成生物体 1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？ ２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？ ３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？ ４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？ 没有 是 成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖 先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理。 思考 ６、细胞膜的主要成份是什么？ ７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？ ８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？ 蛋白质和磷脂 能 注意时间的控制 思考题 ５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？ 胰蛋白酶水解蛋白质 细胞间的成份是蛋白质 ９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？ １０、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？ 不能，因为两者的最适pH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适pH较接近 胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛 思考题 11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？ 12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？ 13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？ 易于培养细胞贴壁，进行生长增殖 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。 将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。 这样的过程叫做传代培养 思考题 14、如何理解原代培养和传代培养？ 15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？ 16、有些为何能一直传下去？ 17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？ 上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养 不都能 发生突变，朝着癌细胞方向发展 不全是 思考题 18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？ 保存10代以内的细胞，因为10－50部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展 思考题 19、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？ 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考并讨论以下问题： 讨论 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境 无菌、无毒的环境。 1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、维生素、血清、血浆等。合成培养基） 保证细胞顺利的生长增殖 培养条件： 动物细胞培养液的主要成分： 葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、维生素、血清、血浆等。 与植物培养基相比其特点是： （1）液体培养基 （2）含有血清、血浆 动物体细胞大都生活在液体的环境 培养条件： 3、温度和pH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 4、气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ） 培养条件： 1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、维生素、血清、血浆等。合成培养基） 思考题 动物细胞培养液的主要成分是什么？ 较植物组培培养基有何独特之处？ 主要成分： 葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、维生素、血清、血浆等。 独特之处有： 1、液体培养基 2、成分中有血清、血浆等 细胞的全能性 细胞株、细胞系 植物体 培养结果 获得细胞或细胞产物 快速繁殖、培育无病毒植株等 培养目的 葡萄糖、血清、血浆 蔗糖、植物激素 培养基特有成分 液体培养基 固体培养基 培养基性质 细胞增殖 原理 动物细胞培养 植物组织培养 比较项目 植物细胞和动物细胞培养的比较 大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体） 作为基因工程中的受体细胞 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据 应用： 概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。 用核移植的方法得到的动物称为克隆动物 核移植 （难度高） 受体细胞：MⅡ期的卵母细胞 二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 细胞分化程度低，恢复全能性容易 细胞质 细胞核 细胞核移植 多莉羊的培育过程 克隆羊培育过程 另一头绵羊的子宫 １、动物的克隆与植物克隆一样吗？ ２、用动物体细胞进行克隆的过程,其实际操作过程是什么？ 动物克隆过程的实际是细胞核移植 不 思考题 卵母细胞去核 体细胞取核 电刺激使两细胞融合 重组细胞 重组胚胎 新个体 １、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？ 为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。 ２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？ 10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变 思考题 3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？ 不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞 思考题 4.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？ 　　在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性． 思考题 5、对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？ 多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核卵母细胞；多莉克隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞。 6、讨论分析上述哪一种更科学？并说明理由？ 卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功 将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便 思考题 胚胎移植技术 试管动物（婴儿）培养过程 受精卵 体细胞核移植技术的应用前景 1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育 2、保护濒危物种，增加存活数量 3、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白 4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植 体细胞核移植技术存在的问题： 许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。 1细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。 2脱分化又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。植物的任何一部分，甚至单个细胞都具有长成完整植株的能力。但要发育成完整植株，必须先脱分化，脱分化的细胞具有发育成任何组织的能力，然后进行再分化，形成完整植株。植物细胞培养主要用于农林生产中的作物、苗木育种，快速繁育种苗、培育无病毒植株等，这就要求植物的组织或细胞先进行脱分化。 动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。 3（1）可以用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达。卢辛达的产奶量很高，说明它有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。 但同时需注意，该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。 3（2）首先从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。 4在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。 在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。