现代实验室诊断在血液病学中的应用及地位

甘肃省人民医院血液科张启科现代实验检验学在血液学中的重要地位*现状 临床血液学和血液检验是多缝交叉、实践性强、发展迅速的学科。 随着国内外研究的不断深入，使得血液病学有了突飞猛进的发展，如白血病亚型的研究，已深入到基因染色体甚至更微观的领域。 临床医师无法通过肉眼判断分型，治疗，预后等重要问。因此，检验科室的实验室结果就显得尤为重要。诊断进展过程 骨髓活检 能弥补骨髓穿刺的不足 了解骨髓细胞的成分及原始细胞分布状况 能观察细胞形态，便于做出病理诊断 对再生障碍性贫血、骨髓异常增生症的诊断具有重要意义 另外对骨髓坏死、骨髓脂肪变也具诊断意义。实验室检查的意义白血病分子检测的临床应用          免疫学检查：确定细胞系来源和分化免疫学检查：确定细胞系来源和分化 免疫表型 儿童 成人 FAB B-系早前-B-ALL普通-B-ALL前-B-ALL成熟-B-ALLT-系前T-ALLT-ALL CD19+HLA-DR+CD10-CD10+CD10+CyIg+CD10±SIg+CyCD3+，CD7+CD2-CD1a-sCD3CD2+CD5±CD8±CD4± 8856515312111 76115110424717 L1L2L1L2L1L3L1L2L1L2PCR方法检测MRD常用的分子标志AML1-ETO t(8;21)(q22;q22) 6~8%原发性AML，在M2中的阳性率为20~40%，在M2b中阳性率为90% 少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综合症 AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对化疗反应较敏感 AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后较其他AML亚型（M3除外）好AML1-ETO 对初发患者进行t(8;21)和AML1-ETO融合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要 AML1-ETO定性结果不能用于评价患者MRD情况 RQ-PCR能实时反映体内AML1-ETO水平。连续定量AML1-ETO转录本水平可判定有高复发风险的患者，以便及早治疗干预以防血液学复发PML-RARα t(15;17)(q22;q21)，98%M3患者阳性 继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及RARα的变异性染色体易位： t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)，dup(17)(q21.3;q23)，t(11;17)(q23;q21)分别产生NPM-RARα，NuMA-RARα和PLZF-RARα，STAT5b-RARα融合基因 临床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解PML-RARα RT-PCR检测PML-RARα是敏感且特异的APL诊断方法，还能用于治疗后MRD监测。PML-RARα阳性提示的分子复发常早于临床复发3-6个月，为临床采取进一步治疗措施提供了保障 RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，在MRD监测中比RT-PCR具有更高价值FLT3基因突变 Fms-relatedtyrosinekinase3 FLT3为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFRβ和c-KIT）成员之一，该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用 据报道，FLT3-ITD和D835突变在AML中阳性率分别为24%(385/1585)和7%(30/429)，总阳性率超过30%，使其成为AML中最普遍发生突变的靶基因 许多临床研究发现，FLT3突变还与临床预后密切相关，尤对60岁以下的AML患者，FLT3突变患者预后较差，且可独立于核型之外CBFβ-MYH11 inv(16)(p13;q22)及t(16;16)(p13;q22) 主要见于M4Eo，10%不伴异常嗜酸细胞M4，少见于M2 CBFβ-MYH11融合蛋白通过干扰核心结合因子（corebindingfactor,CBF）的转录激活作用而致病 具有CBFβ-MYH11的患者对化疗敏感，预后较好，故提高检测率尤具临床意义DEK-CAN t(6;9)(p23;q34) 主要见于M2或M4，也见于M1，MDS-RAEB 伴DEK-CAN的患者年龄一般较轻，且预后较差 此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，调整治疗方案WT-1基因高表达 Wilmstumor1 是无特异分子异常的急性白血病患者理想的MRD检测指标 伴此基因高表达者预后差，且表达程度与预后相关BCR-ABL t(9;22)(q34;q11) 15~30%成人ALL及3~5%儿童ALL 9号染色体的断裂点与CML相同，但22号染色体断裂点具有异质性 此融合蛋白p190刺激细胞增殖的能力比p210要强。在转基因试验中观察到p190诱发的白血病具有起病早、发展快和恶性程度高的特点 BCR-ABL+ALL患者预后差，5年存活率<20%，因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗BCR-ABLBCR-ABL 巢式RT-PCR检测BCR-ABL融合基因用于CML移植患者移植后MRD监测。可在患者血液学复发前的6~24个月骨髓检测就呈阳性。 RQ-PCR还能动态观察患者治疗后BCR-ABL转录本水平变化情况，反映疗效。MLL相关融合基因 累及MLL基因的分子异常见于5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可见于治疗相关白血病，尤接受topoisomeraseII抑制剂治疗的患者 MLL基因涉及五十余种染色体易位，产生不同的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关。最常见的有：t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因ALLt(9;11)(p22;q23)MLL-AF9融合基因AMLt(11;19)(p13;q23)MLL-ENL融合基因AML及ALL血液病临床分子标志物检测(NHLALL) 淋巴系统白血病Acutelymphoblasticleukemia(急性淋巴细胞白血病)Lymphoproliferativedisorders（淋巴性增生性疾病）Malignantlymphomas(恶性淋巴瘤)检测意义 帮助诊断&鉴别诊断&早期治疗 预后提供有价值的基因组信息，指导临床管理和治疗方案的选择1.帮助诊断&鉴别诊断以及早期治疗检测癌基因MYC8q24的易位是诊断Burkitt’s淋巴瘤的分子标准。Burkitt’s淋巴瘤是非常恶性的淋巴瘤需要尽早治疗，但是通过常规病理学手段很难与其它淋巴瘤进行鉴别诊断。促进诊断&鉴别诊断以及早期治疗淋巴组织良、恶性疾病鉴别诊断 淋巴瘤与淋巴组织增生性疾病相鉴别： 分子标记——IgH（FISH、PCR) I级滤泡性淋巴瘤（follicularlymphoma,FL）与滤泡增生为主要病理改变的淋巴结反应性增生相鉴别： 分子标记——t（14;18）（FISH、PCR） 免疫组化、流式细胞术 鉴别诊断 淋巴瘤不同类型鉴别诊断 套细胞淋巴瘤（mantlecelllymphoma,MCL）的母细胞亚型与其它大细胞性B细胞淋巴瘤，尤其是CD5阳性的弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuselargeB-celllymphoma,DLBCL）相鉴别: 分子标记——t（11;14）（FISH、PCR） 小细胞性B细胞淋巴瘤不同类型相鉴别,如FL，黏膜相关淋巴组织（mucosaassociatedlymphoidtissue,MALT）淋巴瘤与MCL: 分子标记——t（14;18），t（11;18）， t（11;14）（FISH、PCR）淋巴瘤同一类型不同亚型鉴别诊断 DLBCL基因表达图谱分为3个亚型： 生发中心B细胞样型（germinalcenterB-cell-like,GCB-DLBCL）：5年生存率59%，12q12拷贝数增加（FISH） 活化B细胞样型（activatedB-cell-like,ABC-DLBCL）： 5年生存率30%，3号染色体三体/3q、18q21-22拷贝数增加/6q21-22缺失（FISH） 原发纵隔型（primarymediastinal,PMBCL）： 5年生存率64%，9p21-pter和2p14-16拷贝数增加（FISH） 皮肤FL鉴别诊断： 原发性皮肤FL：预后较好,罕见t（14;18）(FISH,PCR) 全身系统性FL皮肤表现：预后较差,多见t（14;18）(FISH,PCR) MALT2个分子细胞遗传学亚型： t（11;18）阴性：不易向高级别转化、临床分期较早、对幽门螺旋杆菌（Hp）根除治疗效果较好(FISH,PCR) t（11;18）阳性：临床分期较晚、侵袭性增强、对Hp根除治疗效果不佳(FISH,PCR)Chromosomaltranslocationsofnon-Hodgkin'slymphoma(NHL). NHL类型 Translocation %ofcases Proto-oncogeneinvolved Mechanismofproto-oncogeneactivation Proto-oncogenefunction 浆细胞淋巴瘤 t(9;14)(p13;q32) 50% PAX-5 Transcriptionalderegulation TranscriptionfactorregulatingB-cellproliferationanddifferentiation 滤泡性淋巴瘤 t(14;18)(q32;q21)t(2;18)(p11;q21)t(18;22)(q21;q11) 90% BCL-2 Transcriptionalderegulation Negativeregulatorofapoptosis 套细胞淋巴瘤 t(11;14)(q13;q32) 70% BCL-1/cyclinD1 Transcriptionalderegulation Cellcycleregulator 黏膜相关淋巴瘤 t(11;18)(q21;q21)t(1;14)(p22;q32) 50%rare API2/MLTBCL-10 FusionproteinTrancriptionalderegulation API2hasantiapoptoticactivityAnti-apoptosis(?) 弥漫性大B淋巴瘤 der(3)(q27) 35% BCL-6 Transcriptionalderegulation TranscriptionalrepressorrequiredforGCformation Burkitt淋巴瘤 t(8;14)(q24;q32)t(2;8)(p11;q24)t(8;22)(q24;q11) 80%15%5% c-MYC Transcriptionalderegulation Transcriptionfactorregulatingcellproliferationandgrowth 间变性大细胞淋巴瘤 t(2;5)(p23;q35) 60%* NPM/ALK Fusionprotein ALKisatyrosinekinase *intheadultpopulation;85%inchildhood.染色体和基因改变 染色体异常 受累基因 常见白血病类型 t(8;21)(q22;q22)t(15;17)(q22;q21)t(11;17)(23;21)inv(16)(p13;q22)t(16;16)(p13;q22)t(variable;11q23)t(8;14)(q24;q43)t(9;22)(q34;q11) AML1-ETOPML-RARαPLZF-RARαCBFβ-MYH11CBFβ-MYH11MLL M2M3M3M4EOM4EOM4/M5or其他L3CML,ALL,AML微小残留病 Minimalresidualdisease(MRD)---微小残留病 指白血病诱导化疗完全缓解后或者骨髓移植后残留在体内少 量白血病细胞的状态,可能是导致白血病复发的根源 白血病细胞负荷 初次诊断---1012 形态学缓解---1010以下 分子学缓解---约106-107检测MRD的意义 根据细胞负荷调整缓解后化疗方案 更早发现药物耐药性 更早预测白血病复发 评价骨髓移植净化效果 为实验研究提供依据MRD主要检测方法 一、染色体核型分析 二、荧光原位杂交---FISH 三、流式细胞仪---FCM 四、聚合酶链反应技术---PCR 五、其他：细胞培养技术，免疫荧光等染色体核型分析 常用染色体显带技术检测出染色体畸变,但其成功率依赖于标本中分裂象细胞的数量多少，从而使得检测结果各不相同，且敏感度较低，约1：20FISHfluorescenceinsituhybridization 用荧光素标记染色体特异性探针和特异性基因的DNA探针，通过与间期细胞核DNA或中期染色体DNA原位杂交识别染色体数目和结构的异常，可以进行定性、定位和相对定量分析。 优点：FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核. InterphaseandmetaphaseFISHdemonstratingavariantofthePhiladelphiachromosome.Thegenesthatarerearrangedare: BCR(greenonchromosome22)/ABL(orangeonchromosome9)ThePh’translocationappearsasdualfusion(yellow)signals.RT-PCR逆转录聚合酶链反应技术 利用染色体易位形成的肿瘤特异融合基因或基因重排作为分子靶，在引物作用下，通过聚合酶链反应，短时间内将特异性序列扩增百万倍，然后用凝胶电泳显示出来 优点：特异性、灵敏度大大提高（可达10-5—10-6）QRT-PCR---荧光实时定量PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知进行定量分析的方法。实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具目前real-timeQ-PCR实验成本比较高，且各实验室标准不一，从而也限制了其广泛的应用。MRD检测在AML中的应用 评价AML治疗预后因素 诱导治疗后白血病细胞负荷减少程度及达到CR时间被认为是提示预后的独立因素 MRD检测目的：预示分子学复发，尽早解救治疗巩固治疗结束后MRD检测及其意义 方法的标准化：在有经验的实验室，用低敏感（10-4）RT-PCR方法 PML/RARα（+）定义：指在完成巩固治疗后，间隔4周的二次骨髓标本，在两个有经验的实验室证实 标准方案巩固治疗：MCR可达90%-99% MDR检测结果决定后续治疗选择维持治疗期间和以后的MRD监测 MRD监测适合于高危组患者，低危组患者似乎不需要监测 目前推荐：高危组患者巩固治疗后1年内每1-2个月检测1次，第2、3年每3个月1次 目前常用非定量RT-PCR，Q-RT-PCR的临床应用价值有待确定，但认为动态监测融合基因定量变化可为评估预后提供有益信息，便于调整治疗方案 巩固治疗后RT-PCR持续阴性与长期生存密切相关 一旦转为阳性提示即将血液学复发，需及时治疗22号染色体9号染色体BCRABL113或14211210KD蛋白BCR-ABL基因干细胞学与实验室检测展望 监测MRD对临床治疗策略的指导具体化 检测技术的改进，标准化 拓宽MRD检测应用范围,如淋巴瘤,多发性骨髓瘤等 进一步深入MRD的实验室研究，如对MRD细胞定位，内环境对其生长的影响，增殖动力学，与正常造血间的关系等 实验医学发展已进入分子阶段，但仍不足以揭示所有疾病的发病机制 由于基因的多态性，导致了个体差异，故未来的方向更应趋向于个体化 仍需寻求简便、高效、快捷的试验方法，为血液病诊断更好服务感谢一直以来各位同仁们的大力支持与配合，使得我们的日常工作得以顺利、安全的进行！血液科与实验室都有着良好的发展前景，若创造机会、积极配合，未来一定会有更好、更完善的发展！感谢实验室给我们这样一个沟通和交流的机会，让我们彼此能更进一步的了解，更好的合作！血液科科训 *