紫杉醇对大鼠肺血管平滑肌细胞表型

紫杉醇对大鼠肺血管平滑肌细胞型 空望缱筮塑哩咝翌圭垫！！生！旦笙ｊ！鲞笙！翅鱼堕！』塾缝婴曼笪Ｐ生旦堡，』出！型２：！！！：楚，盟！：２ ・５１Ｉ・ ．论著． 紫杉醇对大鼠肺血管平滑肌细胞表型和细胞骨架的影响 王小双范志宇王涛谢亮余莉 【摘要】 高正祥刘瀚曼 目的探讨不同浓度的紫杉醇对大鼠肺血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及其对细胞 骨架和表犁转化的影响。采用Ｍｒｌｌ’、［３Ｈ］一胸腺嘧啶掺入法检测不同药物浓度紫杉醇对血小板源性生长围子ＢＢ（ＰＤＧＦ—ＢＢ）诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响；采用蛋白质免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）对平滑肌ｄ肌动蛋白及平滑肌２２ｅｔ蛋白（ＳＭ２２ａ）表达活性进行榆测；利用激光共聚焦显微镜观察Ｆ－肌动蛋白的改变。结果与ＰＤＧＦ组比较。紫杉醇药物十预组细胞增殖受到明显抑制．四甲慕偶氮唑盐微量酶反应比色法（ＭｒｒＩ＇）检测抑制率分别为４０．０％，３０．ｏ％，１８．０％（Ｐ＜Ｏ．０１），［３Ｈ］一胸腺嘧啶掺人法测得的细胞增殖抑制率分别为４５．４％，３５．４％，２１．６％（Ｐ＜０．０１），平滑肌Ｃｔ肌动蛋白和ＳＭ２２ａ表达均升高，细胞骨架Ｆ－肌动蛋白的荧光强度明显下降。结论在ＰＤＧＦ－ＢＢ存在的情况下，紫杉醇可剂毋依赖性抑制血管平滑肌细胞的增殖．通过作用于微丝细胞骨架促进血管平滑肌细胞由合成型向收缩型转化，进而影响血管平滑肌细胞的增殖。 【关键词】紫杉醇；肌细胞，平滑肌；细胞表型 ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｐａｃｌｉｔａｘｄＢＢ．ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｉｎｐｌａｔｅｌｅｔ・ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－ ＷＡＮＣ ｐｕｌｍｏｎａｒｙｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ Ｘｉａｏ—ｓｈｕａｎｇ‘．ＭＮＺｈｉ－ｙｕ．时ＮＧ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔａｏ。ＸＩＥＬｉａｎｇ．ＹＵＬｉ．ＧＡＯＺｈｅｎｇ－ｘｉａｎｇ，ｕＵ ｌｔａｎ・ｍｉ亿 Ｕｎｉｔ，耽ｓｔ ＣｈｉｎａＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＷｏｍｅｎａｎｄＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ．盹￡ＣｈｉｎａＳｅｃｏｎｄ 女盯ｔｅＰｕｌｍｏｎａｒｙＶａｓｃｕｌａｒＲｅｍｏｄｅｌｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ．Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｃｈｅｎｇｄｕ６；Ｄ碑ｊ．ＣＡｌｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬＩＵＰｌａｎ．ｍｉｎ．Ｅｍａｉｌ：ｍｙｕｘｕａｎ＠１６３．ｎｅｔ ｆＡｂｓｔｒａｃｔＪ Ｍｅｔｈｏｄｓ ０ｂｊｅｃｔｌｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｒａｔ ｏｎ ｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ（ＰＶＳＭＣ）．ｒａｔｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏｗ∞ｉｎｄｕｃｅｄｂｙＰＤＧＦ—ＢＢａｎｄ ｔｈｅｎｉｎｔｅｒｖｅｎｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｅｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐａｃｌｉ鼬ｘｅＬＭ１ＴＦａｕｄｌ’Ｈ１．ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｃｅｌＩｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＩｅｖｅＩｏｆａｌｐｈａ—ｓｍｏｏｔｈｍｕ￥ｃｌｅ．ａｃｔｉｎｆＳＭ．Ｏｔ．ａｃｔｉｎ）ａｎｄ ｂｙｐｌａｔｅｌｅｔ．ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ—ＢＢ）ｉｎ ＴｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＰＶＳＭＣｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＳＤ ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ２２ａｌｐｈａ（ＳＭ２２ａ）ｗｅｒｅ ｉｎ ｔｅｓｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏＬＣｏｎｆｏｃａｌｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｐｐｌｉｅｄ ａ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｆｌｕｏｒｅｓｅｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ．Ｒｅｓｕｉｔｓ ＴｒｅａｔｎｌｅｎｌｗｉｔｈＰＤＧＦ．ＢＢｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ ｒｅｓｕｌｔｓｉｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｆ’ＨＩ—ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎａｎｄｍａｒｋｅｄｃｈａｎｇｅｉｎｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄ ＷａＳ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ．Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＰＶＳＭＣｉｎｄｕｃｅｄｂｙＰＤＧＦ．ＢＢ．ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅ ４５．４％，３５．４％，２１．６％（Ｐ（０．０１）ｔｅｓｔｅｄｂｙｉ’Ｈｌ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ＳＭ２２∞ＦＩｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆＦ．ａｃｆｉｎ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎａｎｄ４０．Ｏ％，３０．０％，１８．０％ （Ｐ＜０．０１）ｔｅｓｔｅｄｂｙＭｖｒ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅｐａｅｌｉｔａｘｅｌｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＳＭ一旺．ａｃｔｉｎａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｈｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＰａｃｌｉｔａｘｅＩ ｍａｙｐｌａｙ ａｌｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｖａｓｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｂｙｃｈａｎｇｉｎｇｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓＰＤＧＦ．ＢＢ． ａｎｄｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｏｆＶＳＭＣｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙ 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｐａｅｌｉｔａｘｅｉ；Ｍｙｏｃｙｔｅｓ，ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ；Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ 肺动脉高压是指南各种原因引起的肺血管床结 构和功能的改变，导致以肺血管阻力进行性升高为 ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－０９３９．２０１２．０７．００８ 特点的临床综合征，其病理机制涉及呼吸系统、心血 管系统及免疫系统，其中心环节是肺血管的重塑…及平滑肌细胞的异常增殖，因此肺动脉高压的有效治疗靶点应该着眼于通过抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖和促进其凋亡来预防和（或）逆转肺血管重塑口ｏ，最终改善肺动脉高压的预后。本研究选择抗肿瘤药物紫杉醇作为研究对象，通过体外培养肺动脉血管平滑肌细胞（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ． 基金项目：国家基础重点研究发展（９７３）计划（２００７ＣＢ５１１９０５）作者单位：６１００４１成都。四ｊｉ『大学华西第二医院西部妇幼医学研究院肺｜ＩＩＩ管重塑研究室（王小双、范志宇、王涛、高正祥、刘瀚晏）．妇儿疾病与出生缺陷教育部重点实验室（谢亮），儿科教研室（余莉） 通信作者：刘瀚曼．Ｅｍａｉｌ：ｍｙｕｘｕａｎ＠１６３．ｎｅｔ 万方数据 虫堡缝筮塑壁哩盘查！！！！生王旦筮≥！登笠！期！！垫』堡鲢丝曼！竖堑卫鱼，』世！垫！！：！型：篁，§！：！ ＶＳＭＣ），以血小板源性生长因子・ＢＢ（ｐｌａｔｅ｜ｅｔ．ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ—ＢＢ，ＰＤＧＦ—ＢＢ）作为表型转化刺激因 子，探讨紫杉醇在逆转肺ｍ管重塑中的作用特点及机制。 材料与方法 １．大鼠ＶＳＭＣ的培养：健康ＳＤ雄性大鼠，体重１２０—１４０９（购白四川大学华西医学动物实验中心），断颈法处死，在无菌条件下迅速取出肺动脉， 放入超净台中，采用组织贴壁法培养ＶＳＭＣ。培养 液为含２０％胎牛血清（ＦＢＳ）的ＤＭＥＭ培养基（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司）。选取生长旺盛的第３—６代细胞，实验前均用无血清的ＤＭＥＭ培养基同步处理２４ ｈ。 ２．试剂：紫杉醇（美国Ｓｉｇｍａ公司）在无水乙醇中完全溶解，用ＤＭＥＭ培养基稀释成ｌｍｍｏＶＬ储存液，过滤保存备用，使用时稀释为实验用浓度。 ３．分组：（１）ＰＤＧＦ—ＢＢ对照组：ＤＭＥＭ＋ＰＤＧＦ－ＢＢ（美国Ｒ＆Ｄ公司）２０ｍｒ／Ｌ；（２）乙醇对照组： ＤＭＥＭ＋ＦＤＧＦ—ＢＢ（２０ｍｒ／Ｌ）＋０．０５％乙醇溶液； （３）空白对照组：无血清培养基ＤＭＥＭ培养４８ ｈ； （４）低浓度组：ＤＭＥＭ＋ＰＤＧＦ—ＢＢ（２０ｍｒ／Ｌ）＋紫杉醇ｌｎｍｏｌｆＬ；（５）中浓度组：ＤＭＥＭ＋ＰＤＧＦ—ＢＢ２０ｍｇ／Ｌ＋紫杉醇１０ｎｍｏＶＬ；（６）高浓度实验组： ＤＭＥＭ＋ＰＤＧＦ．ＢＢ２０ ｍｒ／Ｌ＋紫杉醇１００ ｎｍｏＶＬ。 ４．［３Ｈ］．ＴｄＲ掺入率测定：将平滑肌细胞按１× １０５个／孔接种于６孔板，待融合至７０％时换用无血 清的ＤＭＥＭ培养基培养２４ｈ，每组设５个复孔，各组分别加入相应的作用因素处理４０ｈ，每孔加入３Ｈ・胸腺嘧啶核苷（１ｍＣｉ／Ｌ），在３７℃、５％ＣＯ：饱和湿 度培养箱继续孵育８ｈ，加入冷ＰＢＳ终止反应，用 １０％三氯醋酸固定，１ ｍｏＶＬ ＮａＯＨ裂解，加入闪烁 液后置于液闪计数仪上测定每孑Ｌ的［３Ｈ］一ＴｄＲ掺入量。细胞增殖抑制率计算公式为：（ＰＤＧＦ・ＢＢ对照 组［３Ｈ］．ＴｄＲ掺入量一药物干预组［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入 量）／ＰＤＧＦ。ＢＢ对照组［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入量。 ５．Ｍ７Ｉ’ｒ法检测细胞增殖抑制率：将长势良好的 ＶＳＭＣ按ｌ Ｘ １０４个／孔接种于９６孑Ｌ板中，待细胞融 合至７０％时换用无血清ＤＭＥＭ培养基２４ｈ，每组设５个复孔，按照上述分组分别进行处理４４ｈ，每孑Ｌ加入２０¨ｌ ５ ｇ／Ｌ的ＭＴｒ溶液（美国Ｓｉｇｍａ公司），继 续培养４ｈ终止培养，小心吸去孔内培养基，每孔加入１５０¨ｌ二甲基亚砜（美国Ｓｉｇｍａ公司）低速震荡 １０ ｍｉｎ，使结晶充分溶解后于酶标仪４９０ｎｍ处检测 各孔吸光度（Ａ）值。细胞增殖抑制率计算公式为： 万方数据 （ＰＤＧＦ—ＢＢ对照组Ａ值一药物干预组Ａ值）／ＰＤＧＦ．ＢＢ对照组Ａ值。 ６．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测蛋白表达：ＶＳＭＣ饥饿２４ｈ 后，各组加入相应浓度的紫杉醇作用４８ｈ后提取总蛋白。采用ＢＣＡ蛋白定量试剂盒（中国碧云天生物 制药有限公司）测定蛋白含量后，取２４斗ｇ蛋白样品在１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳进行蛋白分离，通过电转移 将蛋白印迹转到聚偏氟乙烯（ＰＶＤＦ）膜上，然后放入ｌｏｏ％甲醛中孵育１０ｓ，取出放于通风橱风干以封闭非特异性位点。ＰＶＤＦ膜分别与兔抗平滑肌Ｏｔ肌动蛋白（英国Ａｂｃａｍ公司），兔抗ＳＭ２２ａ（英国Ａｂｃａｍ公司）和小鼠抗ＧＡＰＤＨ单抗（北京中杉金桥公司）４℃孵育过夜。ＰＶＤＦ膜用１０ ｍｌ ＰＢＳ液洗 ５ ｍｉｎ，共３次，再与ＨＲＰ标记的山羊抗兔ＩｇＧ和１：２５００抗小鼠ＩｇＧ（北京中杉金桥公司）３７℃孵育 ｌ ｈｏＥＣＬ发光试剂盒（中国碧云天生物制药有限公 司）检测特异性蛋白条带。 ７．罗丹明．鬼笔环肽检测细胞微丝骨架变化： 将ＶＳＭＣ接种于放有方形盖玻片的６孔板中，待爬片细胞融合至７０％时，饥饿处理２４ｈ，分别按上述 分组处理４８ｈ后，ＰＢＳ漂洗３次，４％多聚甲醛室温同定２０ｒａｉｎ，ＰＢＳ漂洗３次，每次５ｍｉｎ；接着加入 ０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ．１００室温下破膜１０ｒａｉｎ，ＰＢＳ清洗 ３次，每次５ｍｉｎ；然后每张片加入２．５ｍｇ／Ｌ罗丹明－鬼笔环肽（美国Ｓｉｇｍａ公司）５０仙ｌ，３７℃孵育 ３０ ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗３次，每次５ｍｉｎ；抗荧光淬灭封片 液封片，激光共聚焦显微镜观察记录细胞图像。 ８．统计学处理：每组重复样本５个复孔，数据以元±ｓ表示，采用单因素方差，各组数据两两比较使用ｑ检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 结 果 １．ＭＴｒ法检测ＶＳＭＣ增殖的变化：各实验组ＶＳＭＣ吸光度测定结果如表所示，ＰＤＧＦ．ＢＢ刺激后， ＶＳＭＣ表达较对照组显著增高，吸光度值均较 ＰＤＧＦ．ＢＢ组显著降低，随药物浓度的增高，吸光度降低的程度逐渐增加，抑制率分别为１８．０％、３０．Ｏ％和４０．Ｏ％，差异具有统计学意义（Ｆ＝８１１．３０１．Ｐ＜０．叭）。乙醇对照组吸光度与ＰＤＧＦ—ＢＢ组无明显差异（表１）。 ２．紫杉醇对ＰＤＧＦ—ＢＢ诱导的ＶＳＭＣ［３Ｈ］一ＴｄＲ 掺入量的影响：与空白对照组相比，ＰＤＧＦ对照组［３Ｈ］一ＴｄＲ掺入量明显增加（Ｐ＜０．０５），乙醇对照组［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入量与ＰＤＧＦ・ＢＢ对照组相比没有统计 生堡结篮塑唑咝苤盍！！！！生！旦蔓堑鲞筮！塑堕！！』！！！苎堡！！！ｅ堕望Ｌ』！！！！！！！：！！！：箜：盟！：！ ・５１３・ 学差异，紫杉醇能够明显抑制ＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的 阳对分子质量 平鞭， ＶＳＭＣ［３Ｈ］．ＴｄＲ掺入，抑制率随浓度的增加而增 大，抑制率分别为２１．６％，３５．４％和４５．４％，差异有统计学意义（Ｆ＝１９８２，Ｐ＜０．０１，表１）。 表ｌ紫杉醇对血小板源性生长因子（ＰＤＧＦ）．ＢＢ诱导的 肺动脉血管平滑肌细胞增殖的影响（ｉ士ｓ） 曩恩ｒ————卫 ２２ ０００ 平滑肌ｕ肌动簧白 内参照物 注：Ａ：Ｐ“ｂ－一ＤＢ＾ｕ＊最！虬；６：乙．Ｂ手刖托Ｒ蛆；Ｌ：！亡ｂ州Ｈ最差Ｈ；“：１瓜，一量药物干预组；Ｅ：中剂量药物干预组；Ｆ：高剂量药物干预组图７紫杉醇对血小板源性生长因子（ＰＤＧＦ）．ＢＢ诱导的ｍ管平滑肌细胞中收缩表型蛋白平滑肌“肌动蛋白和平滑肌２２ａ蛋白表达的影响 讨论 近年来的研究结果表明，肺动脉高压的终末病 注：。与空白对照组比较，Ｐ＜０．０５；“与ＰＤＧＦ．ＢＢ对照组相比 Ｐ＜０．０５ 理改变为肺小动脉的重塑，主要特点为肺动脉中层 肥厚，由血管平滑肌异常增殖和凋亡减弱导致…。 ＶＳＭＣ可调节自身细胞表型从收缩表型状态到增殖 ３．紫杉醇对ＶＳＭＣ细胞骨架Ｆ－肌动蛋白表达的影响：激光共聚焦显微镜检测结果显示，对照组Ｆ一肌动蛋白纵向平行排列，形成纵贯细胞长轴的整齐的应力纤维，ＰＤＧＦ．ＢＢ刺激后，Ｆ－肌动蛋白表达增强，呈短小束状，无规则的分布在细胞内。乙醇对照组细胞内Ｆ．肌动蛋白的分布类似于ＰＤＧＦ．ＢＢ组，紫杉醇处理ＶＳＭＣ后，细胞内Ｆ一肌动蛋白表达明显减少，荧光强度降低（图ｌ～６）。 的合成表型【３４。正常血管壁中以收缩型为主，维持 收缩血管和调节血管张力，其标志蛋白包括平滑肌ｄ肌动蛋白，平滑肌肌球蛋白重链（ＳＭ．ＭＨＣ）及ＳＭ２２ａ＂１。合成型见于胚胎发育阶段和病理状态，其增殖、移行和分泌能力增强，对分裂因子和血源性生长因子敏感。当血管内皮受损或在体外培养的情况下，ＶＳＭＣ将恢复共分化能力，变现为收缩表型的 标志基因及蛋白表达下调，收缩功能消失，合成和分泌能力增强。当异常因素出去后，合成表型又可以 迅速地可逆性复原为收缩表型。细胞表型转化的基础是细胞骨架的变化。无法控制的肺血管重塑是肺动脉高压的特征性表现，单克隆样增生可见于原发性肺动脉高压的丛样病变，细胞的增长速度和方式誊似恶竹叶癫．巾，Ｉ、概譬牛十长Ｐ子夺奠巾帮莆甲 ４．紫杉醇对ＰＤＧＦ．ＢＢ诱导的ＶＳＭＣ中收缩表 型蛋白平滑肌Ⅱ肌动蛋白和ＳＭ２２ａ表达的影响：空白对照组中的ＶＳＭＣ以收缩表型为主，ＰＤＧＦ—ＢＢ刺激后，平滑肌０【肌动蛋白和ＳＭ２２ａ蛋白表达下降，给予紫杉醇处理后，平滑肌０【肌动蛋白和ＳＭ２２ａ表；七日日再同＃，网７、 圉１—６血小板源性生长因子（ＰＤＧＦ）一ＢＢ刺激后，Ｆ－肌动蛋白表达增强，呈短小柬状。无规则的分布在细胞内（图１），乙醇对照组细胞内Ｆ．肌动蛋白的分布类似于ＰＤＧＦ．ＢＢ组（图２），对照组Ｆ一肌动蛋白纵向平行排列．形成纵贯细胞长轴的整齐的应力纤维（图３），紫杉醇处理肺动脉平滑肌细胞后，细胞内Ｆ．肌动蛋白表达 明显减少，荧光强度降低（图４—６） 罗丹明染色低倍放大 万方数据 生堡结燕塑哩噬苤盔！！１２生！旦筮堑堂笙！翅！！堕』堡鲢望旦！！Ｑ堡垒堡：』！垃垫！！，！丛：箜：型！：！ 要的作用，因此，抗细胞增殖药物可能是治疗重度肺动脉高压的新途径。 紫杉醇是红豆杉树皮的提取物或半合成的细胞周期特异性药物，在不同的药物浓度范同下具有多种 生物学效应，其有效浓度范罔为１—１×１０５ ｎｍｏＬ／Ｌ， 浓度为ｌ～２００ｎｍｏＬ／Ｌ时以被动扩散通过细胞膜直 接作用于细胞微管网，诱导微管蛋白聚合，使维管束 不能与微管组织中心相互连接，将细胞周期阻断于Ｇ２／Ｍ期，抑制细胞的增生、迁移、细胞间转运和跨膜信号转导【６１，发挥非细胞毒性的抗细胞增殖作 用。紫杉醇的靶位点是细胞的微管系统，但微管在 真核细胞中普遍存在，不具有特异性。Ｓｔｅｆｆｅｌ和Ｔａｎｎｅｒ＂１发现紫杉醇可抑制内皮细胞的迁移和增 殖，并诱发内皮细胞功能障碍，武小静等。引也获得 了相似的研究结果，并提出紫杉醇抑制内皮细胞迁移所需的浓度低于抑制增殖所需的浓度。浓度为 １—２００ ｎｍｏＬ／ＬＨ寸紫杉醇表现为抗血管活性和抑制 ＶＳＭＣ增殖的功能，临床已开始应用于药物涂层支 架，并发挥了良好的效果一４“，但尚缺乏对肺动脉高 压等血管增殖性疾病领域的研究。本研究在体外培养ＶＳＭＣ，使用生长因子ＰＤＧＦ—ＢＢ促进细胞增殖并诱导其表型呈合成型，模拟肺动脉高压患者平滑肌增殖表现，结合文献报道及前期预实验结果，选择１、１０和１００ｎｍｏＬ／Ｌ不同浓度紫杉醇进行干预，检测细 胞的增殖情况。结果表明，加入ＰＤＧＦ－ＢＢ刺激２４ ｈ后，ＶＳＭＣｓ的［３Ｈ］．ＴｄＲ和ＭＴＹ表达均明显升高， 收缩表型标志蛋白ＳＭ２２ａ和平滑肌０ｌ肌动蛋白的蛋白表达量明显下降，提示ＰＤＧＦ—ＢＢ可以模拟ＶＳＭＣｓ向合成表型转化的病理状态，与国内外的文 献报道一致¨｝＂Ｊ。紫杉醇干预后，［３Ｈ］．ＴｄＲ和Ｍ１ｒｒ均显示可以剂量依赖性降低细胞增殖和蛋白合成，ＳＭ２２ａ，平滑肌Ｏ／．肌动蛋白的表达呈剂鼍依赖 性回升，提示紫杉醇能够抑制甚至逆转ＰＤＧＦ—ＢＢ诱导的平滑肌细胞表型的转化，并具有剂量依赖性，在前期预实验中，我们发现高浓度的紫杉醇（１¨ｍｏＶＬ）能够直接导致细胞的变性、死亡，因此探索合适的作用浓度至关重要。 以往的资料显示紫杉醇抑制ＶＳＭＣ增殖的机制 主要是与平滑肌细胞的微管结合，而对以微丝为主要细胞骨架的ＶＳＭＣ而言，紫杉醇对ＶＳＭＣ的作用目前尚无报道，本研究通过罗丹明．鬼笔环肽染色法观察了紫杉醇干预后平滑肌细胞的细胞骨架微丝的变化，发现对照组Ｆ－肌动蛋白纵向平行排列，形成 万方数据 纵贯细胞长轴的整齐的应力纤维，ＰＤＧＦ．ＢＢ刺激后，Ｆ一肌动蛋白表达增强，呈短小束状，无规则的分布在细胞内。乙醇对照组细胞内Ｆ一肌动蛋白的分 布类似于ＰＤＧＦ．ＢＢ组，紫杉醇处理ＶＳＭＣ后，细胞 内Ｆ．肌动蛋白表达明显减少，荧光强度降低。提示紫杉醇有可能通过作用于ＰＶＳＭＣ的微丝蛋白。其具体的调节机制有待于进一步研究。 近几年来出现了紫杉醇的新剂型研究，可减少 紫杉醇的不良反应，提高药物浓度，延长药物停滞时间，从而在低毒或无毒前提下提高抗增殖作用。本研究在离体水平初步证实了紫杉醇对ＶＳＭＣ的抗增 殖作ｊ｝ｊ，进涉的研究方向寻找合适的剂型、作用浓 度及给药方式从而使发挥其特异性抗肺小血管增殖作用。 参考文献 ［１］ＪｅｆｆｅｒｙＴＫ，Ｍｏｒｒｅｌｌ ＮＷ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙＶａｓ（‘ｕＩａｒｍｍ，ａｌｅｌｉｎｇｉｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｙｐｅｎｅｎｔｉｏｎ．Ｐｒｏｇ ＣａｒｄｉｏｖａｓｃＤｉｓ，２００２。４５：１７３＿２０２． ［２］千建，冉丕鑫．肺动脉高压血管收缩与重甥的研究．中华结核 和呼吸杂志，２００７，３０：６４５－６４８． ［３］Ｒｅｎ∞ｎＳＭ，ＤｏｅｖｅｎｄａｎｓＰ，ｖａｉｌ Ｅｙｓ Ｇ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａ．ｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｖ＆ｓｃｎｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｄｅｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｎｅｔｈ Ｈｅａｄ Ｊ．２００７，１５：１００—１０８． ［４］Ｌａｖｉｇｎｅ ＭＣ，Ｒａｍｗｅｌｌ ＰＷ，Ｃｌａｒｋｅ Ｒ．Ｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｓｍｏｔｈｒｕｎｓｃｉｅｃｅｌｌｓ．Ｉｎ ＶｉｔｒｏＣｅｌｌＤｅｖＢｉａｌＡｎｉｍ．１９９９．３５：１３６－１４３． ［５］ＴａｎｇＩ）Ｄ。ＡｎｆｉｎｏｇｅｎｏｖａＹ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆ ｔｈｅ ａｅｔｉｎ ｃｙｔｏｓｋｅｈｔｏｎ ｉｎｖａａｆ・ａｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ．ＪＣａｒｄｉｏｖａｓｅ ＰｈａｒｍａｃａｌＴｈｅｒ。２００８．１３：１３０—１４０． ［６］ＺｈｏｕＪｌ，，ＨｕＧＱ．ＨｅｒｒｉｎｇＢＰ．Ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙＥｌｋ．１．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉ０１．２００５． ２５：９８７４－９８８５． ［７］ＳｔｅｆｆｅｌＪ．ＴａｎｎｅｒＦＣ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｒｕｇ・ｅｌｕｔｉｎｇｓｔｅｎｔｓｉｎｔｈｅｅｏｒｏｒｌａｒｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．ＨＰ“，２００７，３２：２６８－２７３． ［８］武小静，黄岚，脚琪．紫杉醇对兔ＪｆｆＬ管内皮和平滑肌细胞增殖 影响的时间效应关系中【｜ｊ动脉硬化杂志，２００５，１３：５－９．『９］Ｓｃｈｉｔｔ ＰＢ，Ｆａｎｌ Ｊ，Ｈｏｒｗｉｔｚ ＳＢ．Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆｍｉｃｒｏｍｂｕｌｅａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙｔａｘ０１．Ｎａｔｕｒｅ，１９７９，２７７：６６５－６６７． 『１０］ＡｘｅｌＤＩ，ＫｕｎｅｒｔＷ。Ｇ６９９ｅｌｍａｎｎＣ．Ｐａｒｌｉｔ“ｅｌｉｎｈｉｂｉｔｓａｒｔｅｒｉａｌ ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ｛＇ｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ｋｗ：ａｌｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃｉｒ（－ｕｌａｔｉｏｎ．１９９７．９６：６３６卅５． ［１１］Ｗａｕｇｈ Ｊ，Ｗａｇｓｔａｆｆ ＡＪ，Ｗａｕｇｈ Ｊ。ｅｔ ａＬ ＴｈｅｐａｃｌｉｔＥｅｌ （ＴＡＸＵＳ）一ｅｌｕｔｉｎｇ ｓｔｅｎｔ：ａｒｅｖｉｅｗｏｆ ｉｔｓ ＵＳｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅ ｎｏｖｏ ｃｏｍｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｌｅｓｉｏｎｓ．ＡｍＪＣａｒｄｉｏｖａｓＤｒｕｇ．２００４，４： ２５７－２６８． ｆ１２］ＥｎｄｌｉｅｈＮ，ＥｎｄｌｉｃｈＫ，Ｔａ８ｃｈＮ．ｅｌａ１．Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍｓｍａｌｌａｔｌｅｒｉｅｓ ｏｆｔｈｅ ｒａｔ ｋｉｄｎｅｙ．ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ． ２０００．５７：２４６８－２４７５． ［１３］吴甍琛，栏磊，李纲，等．体外诱导人骨髓问充质干细胞向血管 平滑肌细胞分化的实验研究．中华整彤外科杂志，２００７，２３： ３３５－３３９． （收稿１３期：２０１１－１０－１７） （本文编辑：蔡蜀菁） 紫杉醇对大鼠肺血管平滑肌细胞表型和细胞骨架的影响 作者：作者单位： 王小双， 范志宇， 王涛， 谢亮， 余莉， 高正祥， 刘瀚旻， WANG Xiao-shuang， FANZhi-yu， WANG Tao， XIE Liang， YU Li， GAO Zheng-xiang， LIU Han-min 王小双,范志宇,王涛,高正祥,刘瀚旻,WANG Xiao-shuang,FAN Zhi-yu,WANG Tao,GAO Zheng-xiang,LIU Han-min(四川大学华西第二医院西部妇幼医学研究院肺血管重塑研究室,成都,610041)， 谢亮,XIE Liang(四川大学华西第二医院妇儿疾病与出生缺陷教育部重点实验室,成都,610041)， 余莉,YU Li(四川大学华西第二医院儿科教研室,成都,610041)中华结核和呼吸杂志 Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases2012,35(7) 刊名：英文刊名：年，卷(期)： 参考文献(13条) 1.Jeffery TK;Morrell NW Molecular and cellular basis of pulmonary vascular remodeling in pulmonaryhypertention 2002 2.王健,冉丕鑫 肺动脉高压血管收缩与重塑的研究[期刊论文]-中华结核和呼吸杂志 2007(9) 3.Rensen SM;Doevendans P;van Eys G Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cellphenotypic diversity 2007 4.Lavigne MC;Ramwell PW;Clarke R Growth and phenotypic characterization of porcine coronary arterysmoth runscle cells 1999 5.Tang DD;Anfinogenova Y Physiologic properties and regulation of the actin cytoskeleton in vascularsmooth muscle 2008 6.Zhou JL;Hu GQ;Herring BP Smooth muscle-specific genes are differentially sensitive to inhibitionby Elk-1 2005 7.Steffel J;Tanner FC Biological effects of drug-eluting stents in the coronary circulation 20078.武晓静,黄岚,周骐,宋明宝,于世勇,晋军 紫杉醇对兔血管内皮和平滑肌细胞增殖影响的时间效应关系[期刊论文] -中国动脉硬化杂志 2005(1) 9.Schiff PB;Fant J;Horwitz SB Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol 1979 10.Axel DI;Kunert W;G(o)ggelmann C Paclitaxel inhibits arterial smooth muscle cell proliferation andmigration in vitro and in vivo using local drug delivery 1997 11.Waugh J;Wagstaff AJ The paclitaxel (TAXUS)-eluting stent:a review of its use in the management ofde novo coronary artery lesions 2004 12.Endlich N;Endlich K;Taesch N Culture of vascular smooth muscle cells from small arteries of therat kidney 2000 13.吴莹琛,崔磊,李纲,尹烁,高永娟,曹谊林 体外诱导人骨髓间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化的实验研究[期刊论文]-中华整形外科杂志 2007(4) 引用本文格式：王小双.范志宇.王涛.谢亮.余莉.高正祥.刘瀚旻.WANG Xiao-shuang.FAN Zhi-yu.WANG Tao.XIELiang.YU Li.GAO Zheng-xiang.LIU Han-min 紫杉醇对大鼠肺血管平滑肌细胞表型和细胞骨架的影响[期刊论文]-中华结核和呼吸杂志 2012(7)