硫酸软骨素的制备工艺

毕业论文题目指导教师专班姓学业级名号天津生物工程职业技术学院2010年41月日 专业班级：07级生物制药3班姓名：岳长华学号：200701335 通讯地址：天津市宝坻区 联系电话：13802151142邮编：301800邮箱：891855433@qq.com 毕业论文 (设计)题目：硫酸软骨素的制备工艺 毕业论文的任务和具体要求： 题目，作者，摘要，关键词，前言，正文，结论，致谢，参考文献 毕业论文应包含的内容简介 摘要：硫酸软骨素是从动物软骨素中提取的黏性多糖。主要含有硫酸软骨素A和硫酸软骨素C等粘多糖成分，用于治疗神经痛、偏头痛、关节痛、心脑血管疾病、高血脂的辅助治疗，也作为食品保健品中的添加剂。在医药、化妆品和食品工业上具有广泛的用途，市场前景广阔。 主要参考资料： [1]李家洲；生物制药工艺学；中国轻工业出版社2007（07）;155-160 [2]周东坡、赵凯等;生物制品学；化学工业出版社；2007（01）145-147 [3]吴晓英，生物制药工艺学；化学工业出版社；2006，139-140 [4]宋涛.硫酸软骨素研究概况[J].食品与药品,2006,(07) [5]陈文华，郭丽梅；制药技术，化学工业出版社，2003（01），157-158 [6]徐庆阳,黎兴荣,石墨,陈宁;硫酸软骨素研究现状[J];生物技术通讯;2004年06期 [7]周学良主编，生物化学品，化学工业出版社2002（11）231-234 [8]舒坤贤;张继承;袁帅;谢永芳;粱亦龙;中华鲟硫酸软骨素提取工艺研究[J];食品工业科技;2006年03期 [9]刘春梅;硫酸软骨素的提取与纯化及性质研究[D];吉林大学;2007年 [10]利用各种动物软骨提取硫酸软骨素的生产技术[N];中国畜牧兽医报;2007年 [11]奇香军；现代生物制药工艺学；化学工业出版社；2004（01）；235，224-225. 任务发出日期：2009年11月 指导教师签名：职称： 年 注：该表从“毕业论文的任务和具体要求”以下为指导教师填写 2任务完成日期：2010年4月月日 指导教师评语及成绩（满分40分）： 指导教师 年（签名）月日 审评小组答辩评语及汇总成绩（满分60分）：最终汇总成绩（满分100分）： 答辩审评组长年月日系主任（签名）职称：年月日 答辩委员会意见： 答辩委员会主任 （公章） 备注：年月日 注：该表为教师填写 3 硫酸软骨素的制备工艺 作者：岳长华天津生物工程职业技术学院07生物三班 摘要：硫酸软骨素是从动物软骨素中提取的黏性多糖。主要含有硫酸软骨素A和硫酸软骨素C等粘多糖成分，用于治疗神经痛、偏头痛、关节痛、心脑血管疾病、高血脂的辅助治疗，也作为食品保健品中的添加剂。在医药、化妆品和食品工业上具有广泛的用途，市场前景广阔。关键词：硫酸软骨素；提取；制备;纯化。 前言：硫酸软骨素系从动物软骨组织中制备获得的一种酸性粘多糖，多存在于动物软骨、鼻骨、喉骨、牛、马中隔和气管、鳖鱼软骨中，它是一种酸性粘多糖，在2709碱性蛋白酶的作用下，粘多糖可以从软骨组织中的蛋白质中离解释放出来。硫酸软骨素临床上可用于预防动脉粥样硬化、提高机体免疫力、治疗风湿病和肾炎及由链霉素引起的听觉障碍。作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。应用于化妆品中，可调节皮肤的细胞代谢，促进营养的吸收，保持皮肤的水分和改善发质。目前，国内外普遍采用碱与酶解相结合的方法来提取硫酸软骨素，还有报道用稀碱稀盐综合提取法、酶解一树脂提取法、酶解一膜提取法、超声波提取法、乙酸抽提法。 正文： 1.硫酸软骨素的简介 硫酸软骨素的药用商品名为康德灵，是提取于动物软骨的黏多糖类物质,，是硫酸软骨素A、C及各种硫酸软骨素的混合物，硫酸软骨素一般含有50-70个双糖分子，链长不均一，分子量在1万-3万之间，在心血管疾病、关节病的防治等方面具有重要的作用,是目前市场上较重要的生化产品..硫酸软骨素除了作为药品外,大量的是作为改善关节病的补充品,作为健康食品应用,在美国已经风行多年.经过多年的应用,已经证明硫酸软骨素对改善老年退行性关节炎、风湿性关节炎有一定的效果,因此市场仍呈快速上升的势头.仅在美国的消量每年就可达600吨左右.而中国有13亿人口,患老年退行性关节病和冠心病的人很多,因此有着硫酸软骨素消费的巨大潜在市场。 自然界中，硫酸软骨素多存在于动物软骨、喉骨、鼻骨。牛马中隔和气管中，其他骨腱、韧带、皮肤、角膜等组织中也含有，鱼类软骨中含量很丰富，如鲨鱼骨含50%—60%,结缔组织含量很少。原腔动物、海绵动物、原生动物也含有，植物中几乎没有。软骨中的硫酸软骨素与蛋白质结合以蛋白多糖的形式存在。 2.硫酸软骨素的理化性质 2.1物理性质 4 本品呈本白色粉末状，略带咸味，无臭，具有较强引湿性，易溶于水并形成粘稠溶液，不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂，堆积密度为0.65-0.75g/ml。硫酸软骨素盐对热较稳定，受热80℃亦不被破坏，游离硫酸软骨素水溶液遇高温不稳定，主要是脱乙酸基或降解成单糖或分子量较少的多糖。 2.2化学性质 2.2.1水解反应硫酸软骨素可被硫酸降解成小分子组分,并被硫酸化,降解的程度和硫酸化的程度随温度升高而增加,在-30--5°C的温度下,2h可使平均相对分子质量降至3000-4000。硫酸软骨素还可以在稀盐酸溶液中水解而成为小分子产物,温度越高,水解速率越快[1]。 2.2.2酯化反应 物。 2.2.3中和反应硫酸软骨素呈酸性,其聚阴离子能与多种阳离子生成盐。这些阳离子包括硫酸软骨素分子中的游离羟基可以被酯化,而生成许多种硫酸衍生金属离子和有机阳离子如碱性染料甲苯胺蓝等。可利用此性质对其进行纯化,如用阴离子交换树脂纯化等。 3.硫酸软骨素的作用 3.1药理毒理作用 硫酸软骨素广泛存在于人和动物软骨组织中。其药用制剂主要含有硫酸软骨素A和硫酸软骨素C两种异构体，不同品种、年龄等动物的软骨中硫酸软骨素的含量不同。其药理作用表现如下。 3.1.1．硫酸软骨素可以清除体内血液中的脂质和脂蛋白，清除心脏周围血管的胆固醇，防治动脉粥样硬化，并增加脂质和脂肪酸在细胞内的转换率。 3.1.2．硫酸软骨素能有效地防治冠心病。对实验性动脉硬化模型具有抗动脉粥样硬化及抗致粥样斑块形成作用；增加动脉粥样硬化的冠状动脉分枝或侧支循环，并能加速实验性冠状动脉硬化或栓塞所引起的心肌坏死或变性的愈合、再生和修复。 3.1.3．能增加细胞的信使核糖核酸（mRNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的生物合成以及具有促进细胞代谢的作用。 3.1.4．抗凝血活性低。硫酸软骨素具有缓和的抗凝血作用，每lmg硫酸软骨素A相当于0.45U肝素的抗凝活性。这种抗凝活性并不依赖于抗凝血酶Ⅲ而发挥作用，它可以通过纤维蛋白原系统而发挥抗凝血活性。 3.1.5．硫酸软骨素还具有抗炎，加速伤口愈合和抗肿瘤等方面的作用。 3.2药代动力学 5 降血脂药。主要用于治疗高脂血症。其临床应用包括以下几方面。 3.2.1．硫酸软骨素作为保健食品或保健药品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗死、冠状动脉粥样硬化、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。长期的临床应用发现，在动脉和静脉壁上沉积的脂肪等脂质可以被有效地去除或减少，能显著降低血浆胆固醇，从而防止动脉粥样硬化的形成。 3.2.2．硫酸软骨素用于治疗神经痛、神经性偏头痛、关节痛、关节炎以及肩胛关节痛，腹腔手术后疼痛等。 3.2.3．预防和治疗链霉素引起的听觉障碍以及各种噪音引起的听觉困难、耳鸣症等，效果显著。 3.2.4．对慢性肾炎、慢性肝炎、角膜炎以及角膜溃疡等有辅助治疗作用。 3.2.5．近年来报道，鲨鱼软骨中的软骨素有抗肿瘤的作用。此外，硫酸软骨素还应用于化妆品以及外伤伤口的愈合剂等。 3.2.6．硫酸软骨素还用于滴眼 4.硫酸软骨素的生产工艺 硫酸软骨素的生产工艺有稀碱提取工艺，稀碱-浓盐提取工艺，和酶解-树脂提取工艺，超声波辅助法，乙酸提取法。 4.1稀碱提取工艺[3] 稀碱提取工艺缺点是时间长、液体体积大、乙醇用量大,但是稀碱提取工艺产品的颜色好,相对分子质量大,精制时容易.稀碱提取工艺主要利用蛋白酶水解蛋白质的特异性，使硫酸软骨素从糖蛋白中游离出来的提取方法。该法通常是先用碱溶液提取硫酸软骨素，再加入蛋白酶， 使蛋白质水解，此法的硫酸软骨素得率与碱法相差不多，但其纯度明显提高，其工艺如下： 6 4.1.1预处理:将新鲜的软骨除去脂肪等结缔组织后，置于冷库中保存，用时取出，粉碎。 4.1.2提取:将软骨洗净煮沸，除去脂肪和其它结缔组织，粉碎机粉碎后，加入4倍量的2%氢氧化钠溶液搅拌提取24h，用纱布过滤，滤渣再用2倍量的2%氢氧化钠溶液搅拌提取12h，过滤，合并两次提取液，弃去滤渣。 4.1.3酶解:将上述合并的滤液置于消化罐中，搅拌下加入1：1盐酸调节pH值8.5-9.0，加热至50度，加入适量的胰酶酶解4-5h，取酶解液。 4.1.4吸附:酶解液用盐酸调节pH值6.8-7.0，加入适量白土，1%活性炭搅拌吸附1h，过滤，弃去滤渣。 4.1.5沉淀:滤液调节pH值6.0，加入90%以上的乙醇使醇含量为70%。静置，上清夜澄清时，去上清夜，乙醇回收，下层沉淀脱水干燥得粗品。 4.1.6精制:将上述粗品按10%左右浓度溶解，并加入1%氯化钠。加入1%胰酶酶解3h然后升温至100度，过滤至清，滤液用盐酸调节pH值2-3过滤，用氢氧化钠调节pH值6.5，然后用90%乙醇沉淀，无水乙醇脱水，真空干燥得精品。 4.2稀碱-浓盐提取工艺 稀碱-浓盐提取法不需酶解和脱色处理,产品色泽白,疏松,含量一般为75%~85%,收率在10%~15%之间,符合口服质量,操作简便,成本较低,生产周期短,适合大规模生产。但在稀碱-浓盐提取工艺中，提取工序升高温度，产量有明显增加，而提取液颜色变深影响产品质量和外观。稀碱-浓盐提取法是利用碱性条件下糖蛋白发生水解，使硫酸软骨素以游离态释放出来的提取方法，使用碱性浓盐提取，可使胶原蛋白硫酸软骨素复合物发生解离，对未解离的复合物部分，在盐解过程中会进一步解离，解离后的蛋白质在高离子强度下沉淀，从而达到分离的目的， 其工艺路线为： 4.2.1预处理:将新鲜的软骨除去脂肪等结缔组织后，置于冷库中保存，用时取出，粉碎 7 4.2.2提取:将搅碎的软骨放入不锈钢反应罐中，加3-3.5mol/LNacl浸没，用50%的NaoH调节pH至12-13，搅拌提取10-15h，过滤，滤渣同上重复重提一次，提取过程中应随时校正pH，合并两次提取液。 4.2.3盐解：将提取液放入不锈钢反应罐中，用2mol/LHcL调节PH至7-8，搅拌条件下迅速升温80-90度保持20分钟，冷却，过滤，收集盐解液。 4.2.4除酸性蛋白：将盐解液倾入搪瓷罐中，用2mol/L盐酸调节PH至2.6，搅拌10分钟，静置3-4h过滤至澄清，然后调节PH到6.5，加2倍去离子水，使溶液氯化钠浓度为1mol/L左右。 4.2.5沉淀：将上述溶液至于搪瓷罐中，加入95%乙醇，使醇体积分数达到50%-60%，存放至清，虹吸除上清液。 4.2.6干燥：将沉淀抽干，然后用95%乙醇脱水2-3次，70度以下真空干燥得成品。 4.3酶解-树脂提取工艺 酶解-树脂提取工艺制得的硫酸软骨素样品，经纸电泳检查为单一区带，抗原物质实验结果为阴性，含硫量为7.2%。其优点是酶水解或稀碱水解与树脂交换技术相结合，保证了硫酸软骨素分子不被降解，解决了成品纯度问题。方法简便、收率高，是一种较有实用价值的制备方 法。 将软骨绞碎，加入1mol/L氢氧化钠溶液浸泡，40摄适度保温水解2h或加pH值7.5的水浸泡，用蛋白酶在55度保温下水解20h，再加盐酸中和至中性，过滤，调整滤液中氯化钠浓度达到0.5mol/L。然后将溶液通过AmberliteIRA-933型离子交换树脂柱，吸附完毕，用0.5mol/L氯化钠液洗涤，再用1.8mol/L氯化钠液洗脱，流速2L/h，洗脱液脱盐，乙醇沉淀，离心，收集沉淀，真空干燥得成品[3]。 4.4超声波辅助法 8 超声波辅助法是利用超声波的空化作用，使物料周围形成空穴，从而有利于硫酸软骨素提取的方法。蒲志军等(2000)采用超声波辅助的碱提酶解法提取猪喉骨中的硫酸软骨素时发现，与常规的碱提酶解法相比，硫酸软骨素的提取率和纯度并不明显提高，但超声波辅助法可大大缩短提取时间。 4.5乙酸提取法 Nakono等(2000)利用乙酸水溶液提取硫酸软骨素。通过乙酸提取法可以把牛鼻软骨中7O以上的硫酸软骨素缩糖浸出，影响硫酸软骨素浸出率的主要因素是pH，若在抽提硫酸软骨素时加入乙酸钠，在相同条件下可使硫酸软骨素浸出率提高6。 五、硫酸软骨素的纯化 硫酸软骨素的纯化主要有溶剂法、季铵盐化合物沉淀法、超滤膜法、色谱法、电泳法。 4.5.1溶剂法 溶剂法是利用软骨中不同化学成分的溶解性差异，而将硫酸软骨与其他杂质相互分离的纯化方法。Nicola将硫酸软骨素溶于浓度为29／6(m／V)的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到较高纯度的硫酸软骨素。采用甲醇或丙酮时，也可得到同样的效果。 4.5.2季铵盐化合物沉淀法[11] 硫酸软骨素在溶液中以聚阴离子形式存在，与季铵盐化合物(如溴化十六烷基甲铵或氯化十六烷基吡啶等)可形成水溶性很小的季铵盐络合物。这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，但当其增大到临界离子强度时，可发生解离并溶解，利用该性质可使硫酸软骨素得到纯化。该纯化法一般需要控制硫酸软骨素的浓度为0．1～1．0(m／v)，浓度过高，会使季铵盐化合物与其中的杂质发生沉淀反应。 4.5.3超滤膜法 超滤膜法是利用滤膜孔径的不同使硫酸软骨素与其它非多糖类杂质分开，而得到分子量分布范围较窄且纯度较高的硫酸软骨素的方法。电场强化超滤使利用硫酸软骨素在电场作用下发生电泳而离开膜表面，从而有利于杂质透过膜被除去。声场强化超滤是利用其具有的搅拌作用和产生的空化效应，使膜表面沉积的硫酸软骨素浓度降低，从而提高杂质的透过率。 9 4.5.4色谱法 离子交换色谱法是依靠库仑力的作用将物质吸附在交换剂上，然后选用适合的洗脱剂进行洗脱，达到其纯化的目的。常用于硫酸软骨素纯化的阴离子交换剂有树脂、纤维素和葡聚糖凝胶等。 4.5.5电泳法 采用双向电泳法纯化硫酸软骨素，第一相电泳条件为pH6.0的吡啶/醋酸/水（10∶1∶89，v/v）缓冲液，电场强度7.5V/cm，电泳60min；第二相电泳条件为pH7.7的醋酸钡缓冲液，电场强度为7.5V/cm，电泳130min，得到纯度为82％的硫酸软骨素[17]。NicolaV采用琼脂糖凝胶电泳（50mm×70mm，4mm～5mm厚），电泳条件为0.05mol/L的1,2-二氨基丙烷缓冲液（醋酸调pH至9.0），电流为50mA，电泳80min，可得到纯度为90％的硫酸软骨素，但其回收率仅为45％[18]。NicolaV采用硝化纤维素膜电泳（60mm×100mm，孔径0.45mm），加样量为1.0mg～10.0mg，电泳条件为0.1mol/L的醋酸钡缓冲液，泳动度为5.75×10-3cm/A·min，电泳40min，可得到纯度为100％的硫酸软骨素，其回收率也为100％。 5.硫酸软骨素常用的分析方法 硫酸软骨素常用的分析方法有比色法,质量法,定氮法[11] 5.1比色法: 比色法是根据Elson-Morgan反应进行。用此反应测定分子组成中的2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖和2-氨基-2-脱氧-D-半乳糖,包括用碱性乙酰丙酮处理生成的几个生色基团与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,以分光光度法测定吸收值,同时用氨基己糖制备标准曲线，操作时,先用HCL水解硫酸软骨素生产氨基己糖,在碱性条件下与乙酰丙酮反应,在与对二甲氨基苯甲醛缩合,生成红色化合物。 5.2质量法:在氧化条件下使硫酸软骨素水解释放出硫酸根,再加钡盐使其生成BaSO4沉淀,然后按硫酸钡分子形式,以质量法测定其含硫量。 5.3定氮法:硫酸软骨素分子中含氮量为3.05%,多余的氮则作为蛋白质、多肽及氨基酸等杂质的度量。因此含氮量测定可作为样品的含量及纯度检查标准。 10