玉米须对2型糖尿病模型大鼠降糖机制讨论

玉米须对2型糖尿病模型大鼠降糖机制讨论 玉米须是禾本科玉蜀黍属植物玉米stigma maydis L.的花柱和柱头，含有甾醇、多糖、皂苷、黄酮等化学成分，具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等作用，民间常以玉米须做药茶用于糖尿病、高血压病的辅助治疗。目前，玉米须的降糖机制研究集中于其能够促进肝糖原、肌糖原的合成及保护胰岛细胞等功能，而对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)因脂质代谢紊乱诱发的胰岛素抵抗研究尚不充分。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)是一种组织细胞分泌性基质蛋白，是引起胰岛素抵抗的一个诱因。本研究通过建立T2DM大鼠模型，考察玉米须对模型大鼠脂肪组织SPARC达的影响，并观察胰腺病理结构的改变，探讨玉米须治疗糖尿病的作用机制。 材料 1. 药材与试剂 玉米须药材购于安国市奉义中药饮片有限公司，经黑龙江省中医药科学院王伟明教授鉴定为玉米须stigma maydis L.;链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司);血糖试纸(罗氏公司);RNA提取试剂(Trizol);RNA逆转录试剂盒(TaKaRa);PCR试剂盒(TaKaRa);SPARC及内参(-actin)引物(Invitrogen公司);蛋白裂解液及BCA试剂盒(中国碧云天生物试剂公司);内参(-actin)抗体及SPARC单克隆抗体(Abcam公司);内参二抗及SPARC二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);ECL显色试剂盒(英国安马西亚公司)。 2 . 仪器 AC C U- C H E K型血糖仪(德国罗氏公司);LineGene 9600聚合酶链式反应(PCR)仪(杭州博日科技有限公司);VersaDoc MP 5000凝胶成像仪(BIO-RAD公司);TY10170-3930型WESTERN BLOT湿法转膜仪(BIO-RAD公司);DYCZ-24DN型电泳仪(北京六一公司);infinite M200PRO酶标仪(瑞士Tecan公司)。 3. 动物及饲料 SPF级SD雄性大鼠，体质量(20020)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，合格证号：11400700049303;高脂饲料由实验室按如下配方配制：基础饲料79.5%、蛋黄粉10%、猪油10%、猪胆盐0.5%。 方法 1. 玉米须提取物的制备 称取玉米须500g，将其切短，用10倍量水室温浸泡10h，于80℃水浴中浸提2次，每次3h，过滤，合并滤液，于80℃减压浓缩并真空干燥，保存于-20℃备用。临用时，取适量加蒸馏水溶解配制成0.1g/mL的溶液。 2. 糖尿病模型的建立 参考文献方法。40只大鼠随机分笼，适应性饲养1周，期间自由进食基础饲料，自由饮水。除正常组(10只)给予基础饲料喂养外，其余大鼠给予高脂饲料喂养4周后，禁食不禁水16h，每只大鼠按35mg/kg剂量一次性腹腔注射2%STZ工作液(4℃预冷的0.1mmol/L柠檬酸缓冲液新鲜配制，避光，pH值4.5)。正常组则注射相应剂量的柠檬酸缓冲液，分别于注射后3、7d测定空腹血糖，空腹血糖11.1mmol/L维持3d者，确定为T2DM模型，不成模者弃去。 3. 分组、给药、取材 将造模成功的20只大鼠随机分为两组，即模型组和给药组，每组10只。正常组和模型组给予蒸馏水灌胃，给药组灌胃给予玉米须提取物，给药量按照《中华人民共和国卫生部药品标准》1985年版一部规定的成人日用量最大30g折算成标准200g大鼠的给药量为2.7g/kg。给药组间，正常组给予普通饲料，模型组及给药组大鼠继续喂以高脂饲料4周至实验结束。连续给药4周后，通过每组大鼠尾静脉采血测定空腹血糖，然后用水合氯醛腹腔注射麻醉，分别取腹部脂肪组织立即置入液氮中，最后放入-80℃冰箱保存备用，另取各组大鼠胰腺，用滤纸吸干表面水分，立即放入10%甲醛溶液中固定用于病理组织检查。 4. 胰腺组织病理学观察 将10%甲醛固定的胰腺组织采用常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜检查，观察胰腺组织病理变化。 5. RT-PCR法检测各组大鼠脂肪组织中 SPARC mRNA的表达 取脂肪组织50mg，加1mL Trizol试剂提取总RNA。用酶标仪测定RNA的浓度和纯度，采用荧光定量PCR法检测不同组别大鼠脂肪组织SPARC mRNA表达水平。目的基因SPARC的上游引物序列：5-GAA GGT ATA TGC AGC AAT GAC AAC AA-3，下游引物序列：5-TTC GGT CAG CTC GGA ATC CA-3。-actin(内参)上游引物序列：5-CCC AGC ACA ATG AAGATC AAG ATC AT-3，下游引物序列：5-ATC TGC TGG AAGGTG GAC AGC GA-3。RT反应体系20L，37℃温育15min，85℃加热5s，5℃保持5min终止反应。PCR扩增采用50L反应体系。PCR：预变性阶段：95℃ 30s;PCR反应阶段：95℃5s，60℃ 20s，共40个循环，同时扩增-actin作为内参。根据相对定量法2-CT法对扩增结果进行数据分析。 6. Western blot法检测各组大鼠脂肪组织SPARC蛋白的表达 将冻存的脂肪组织加入液氮研磨后加入蛋白裂解液，10 000r/min离心5min后取上清液。用BCA法测定蛋白浓度。取约60g总蛋白加入SDS-PAGE凝胶槽中，首先经恒压50V、30min后，当溴酚蓝到达浓缩胶与分离胶的界面时电压提高至100V，直至溴酚蓝到达分离胶底部。湿法转膜：恒流200mA，90min。5%BSA封闭2h，按照1∶1 000稀释一抗，4℃孵育过夜，1∶2 000稀释二抗孵育90min，然后经ECL化学发光系统显色,用Quantity one软件处理条带的灰度值。以SPARC/-actin代表SPARC蛋白的相对表达量。 7. 统计学方法 对实验数据进行统计分析，以x-s表示，采用SPSS 12.0软件进行统计分析，两组间差异比较采用t检验，以P0.05为差异有统计学意义。 结果 1. 玉米须提取物对大鼠血糖的影响。与正常组比较，模型组大鼠空腹血糖明显升高(P与模型组比较，给药组大鼠空腹血糖明显下降(P0.05)。 2. 玉米须提取物对大鼠胰腺病理结构的影响 。正常组外分泌腺与胰岛之间界限清晰，胰岛细胞密度高，形态规则;模型组胰岛受损严重，周界不清，形态不规则，胞核固缩，体积缩小，胰岛细胞胞浆内有空泡，胰岛外出现大面积脂肪异位沉积;给药组外分泌腺与胰岛周界清楚，形态比较规则，胰岛细胞结构基本正常，排列规则整齐，胰岛细胞密度较模型组有较大增加，胰岛外仍有脂肪沉积，胰岛细胞胞浆内几无空泡。中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年10月第31卷第10期 CJTCMP , October 2016, Vol . 31, No. 10 4255 3. 玉米须提取物对T2DM模型大鼠脂肪组织SPARC mRNA表达的影响 见表2。RT-PCR检测结果显示：与正常组比较，模型组大鼠脂肪组织中SPARC mRNA大量表达(P0.05)，给药组大鼠脂肪组织中SPARC mRNA表达显著低于模型组(P0.05)。 讨论 SPARC是一种与T2DM的发病密切相关的小分子糖蛋白，Nie J等研究表明，SPARC能够抑制脂肪合成，促进脂肪纤维化，一方面游离脂肪酸在体循环中通过抑制胰岛素刺激对葡萄糖的摄取利用及阻断胰岛素信号通路引起胰岛素抵抗，另一方面当游离脂肪酸沉积于非脂肪组织中时形成异位脂肪沉积进而引起非脂肪组织的胰岛素抵抗，如当沉积于胰脏时产生脂毒性而对胰岛细胞产生损伤，同时SPARC抑制脂肪合成时会导致脂肪细胞病理性肥大，从而诱发脂肪组织炎性反应，导致脂肪组织的炎性因子如IL-6、TNF-等聚集增加，这些炎性因子除了本身可以通过阻断胰岛素信号通路及减少GLUT4的表达加重胰岛素抵抗外，又会加重脂肪的异位沉积。且研究表明，糖尿病患者血清的SPARC含量高于正常人，而脂肪组织炎性反应、胰岛素、瘦素为调节SPARC含量升高的主要因素，升高的SPARC又会导致异位沉积、脂肪组织炎性反应最终导致胰岛素抵抗从而形成一个恶性循环。玉米须作为我国传统的中药材，最早收载于《滇南本草》，对糖尿病具有一定的辅助治疗作用。本实验结果表明，玉米须提取物能够降低T2DM模型大鼠血糖水平，并且因脂肪异位沉积于胰脏对胰岛细胞产生的损伤具有一定的修复作用，通过RT-PCR和Western blot技术检测到给药组脂肪组织SPARC的mRNA和蛋白表达显著下降，说明玉米须提取物降低血糖改善胰岛素抵抗的机制可能与其抑制SPARC的表达相关。SPARC含量下降进而减弱其在T2DM模型病大鼠脂肪组织中抑制脂肪合成促进脂肪纤维化的作用，因而减轻了脂肪异位沉积的程度。