为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!

酶活测定方法

2019-02-18 15页 doc 66KB 212阅读

用户头像

is_650122

暂无简介

举报
酶活测定方法二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定 一、目的要求 了解多酚氧化酶的作用,掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。 二、基本原理 多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)是一种以铜为辅基的酶,能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物,醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中,果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。 多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。因此,可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。 三、材料、仪器及试剂 (...
酶活测定方法
二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定 一、目的要求 了解多酚氧化酶的作用,掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定。 二、基本原理 多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)是一种以铜为辅基的酶,能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物,醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中,果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。 多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。因此,可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。 三、材料、仪器及试剂 (一)材料 梨、苹果、马铃薯等。 (二)仪器及用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶(100mL、1000 mL)。 (三)试剂 1.100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液 母液A(200 mmol/L醋酸溶液):量取11.55 mL冰醋酸,加蒸馏水稀释至1 000 mL。 母液B(200 mmol/L醋酸钠溶液):称取16.4 g无水醋酸钠(或称取27.2 g三水合乙酸钠),用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。 取68 mL母液A和432 mL母液B混合后,调节pH至5.5,加蒸馏水稀释至1 000 mL。 2.提取缓冲液(含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100) 称取340 mg PEG 6000(聚乙二醇6000)、4 g PVPP(聚乙烯吡咯烷酮,Polyvinyl–polypyrrolidone),取1 mL Triton X-100,用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。 3.50 mmol/L邻苯二酚 称取275 mg邻苯二酚,用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mL。 四、实验步骤 (一)酶液制备 称取5.0 g果蔬组织样品,置于研钵中,加入5.0 mL提取缓冲液,在冰浴条件下研磨成匀浆,于4℃、12 000×g离心30 min,收集上清液即为酶提取液,低温保存备用。 (二)活性测定 取一支试管,加入4.0 mL 50 mmol/L、pH 5.5的醋酸缓冲液和1.0 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液,最后加入100 μL酶提取液,同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中,置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比,在反应15 s时开始反应体系在波长420 nm处吸光度值作为初始值,然后每隔1 min 记录一次,连续测定,至少获取6个点的数据。重复三次。 五、实验结果与计算 1.将测定的数据填入下表 重复 次数 样品 重量 W (g) 提取液 体积V (mL) 吸取样 品液体积 Vs (mL) 420 nm吸光度值 样品中PPO活性 (△OD420·min-1·g-1 FW) OD0 OD1 OD2 OD3 OD4 OD5 △OD 计算值 平均值±偏差 1                         2                       3                                                 2.计算结果 记录反应体系在420 nm处的吸光度值,制作OD420值随时间变化曲线,根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD420。然后以每克鲜重(FW)果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO活性单位(U),则U = △OD420·min-1·g-1 FW。计算公式: 式中: △OD420——反应混合液的吸光度变化值; △t ——酶促反应时间,min; V ——样品提取液总体积,mL; Vs——测定时所取样品提取液体积,mL; W ——样品重量,g。 PPO活性还可以每分钟反应体系在波长420 nm处吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位(U),表示为U = △OD420·min-1·mg-1蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。 六、注意事项 应进行预实验,测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化,确定该酶促反应速度呈线性变化(初级反应)的时间段。这样,只测定某一段时间内反应溶液的初始吸光度值(OD0)和最终值(ODt)这两个数据,就可以计算每分钟吸光度值变化的增加量。 七、思考 随着反应时间的延长,多酚氧化酶活性将呈现什么样的变化? (四)超氧化物岐化酶活性测定 一、目的要求 学习果蔬组织中过超氧化物歧化酶活性的测定原理和方法。 二、基本原理 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)普遍存在于动、植物与微生物体内。SOD是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD:Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD。SOD能够清除超氧自由基(O2-),它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害,从而减少自由基对有机体的毒害。 超氧阴离子自由基(O2-)是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基,生成H2O2和O2。H2O2再由CAT进一步催化生成H2O和O2。超氧化物岐化酶催化以下反应: 由于超氧自由基非常不稳定,寿命极短,一般利用间接方法测定SOD活性。本实验依据SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在时,核黄素可在光照条件下被还原。被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-。当加入NBT后,在光照条件下O2-又可将NBT还原为蓝色的甲腙,后者在560 nm处有最大光吸收。 当加入SOD时,SOD可通过清除O2-而抑制了NBT的光还原反应,使蓝色甲腙生成速度减慢。于是,进行光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶的活性愈低,反之酶的活性愈高。抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系,据此可以计算出酶活性的大小。常常将抑制50%的NBT光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位(U)。 三、材料、仪器及试剂 (一)材料 苹果、梨、番茄等。 (二)仪器及用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、光照箱(反应试管处日光灯照度为4 000 LUX)、指形玻璃管、容量瓶(100 mL、200 mL、1 000 mL)。 (三)试剂 1.提取缓冲液: (1)100 mmol/L、pH 7.8磷酸缓冲液 母液A(200 mmol/L Na2HPO4溶液):称取35.61 g Na2HPO4·2H2O或53.65 g Na2HPO4·7H2O或71.64 g Na2HPO4·12H2O,用蒸馏水溶解,定容至1 000 mL。 母液B(200 mmol/L NaH2PO4溶液):称取27.6 g NaH2PO4·H2O或31.2 g NaH2PO4·2H2O用蒸馏水溶解,定容至1 000 mL。 取91.5 mL母液A和8.5 mL母液B混合后,调节pH至7.8,然后稀释至200 mL,即为100 mmol/L、pH 7.8磷酸缓冲液。 (2)提取缓冲液 称取77 mg DTT,5 g PVP,加入100 mmol/L、pH 7.8磷酸缓冲液,定容至100 mL,摇溶,即得提取缓冲液(含5 mmol/L DTT和5% PVP),低温(4℃)贮藏备用。 2.50 mmol/L、pH 7.8磷酸缓冲液 3.130 mmol/L甲硫氨酸(MET)溶液 称取1.94 g L-蛋氨酸,用50 mmol/L、pH 7.8磷酸缓冲液溶解,定容至100 mL,充分混匀(现用现配)。低温保存,可使用1~2天。 4.750 μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液 称取61.3 mg NBT,用蒸馏水溶解,定容至100 mL,充分混匀(现配现用)。低温避光保存,可用2~3 天。 5.100 μmol/L EDTA-Na2溶液 称取37.2 mg EDTA-Na2,用蒸馏水溶解,定容至100 mL,使用时稀释100倍。低温避光保存可用8~10天。 6.20 μmol/L核黄素溶液 称取75.3 mg核黄素,用蒸馏水溶解,定容至100 mL,使用时稀释100倍。低温避光保存,即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好,随用随配。 四、实验步骤 (一)酶液制备 称取5.0 g果蔬样品,置于研钵中,加入5.0 mL提取缓冲液,在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入到离心管中,于4℃、12 000×g离心30 min,收集上清液,低温保存备用。 (二)活性测定 用5支指形玻璃管进行测定。按照表19所列内容加入各种溶液。注意最后加入核黄素溶液。其中3支为测定管,2支为对照管。混匀后将1支对照管置于暗处,其它各管置于4 000 LUX日光灯下反应15 min后,立即取出,置于暗处终止反应。以不照光管做空白参比,于560 nm处分别测定其它各管的吸光度值。 表19.测定SOD活性各试剂加入量 试 剂(酶) 用量(m L) 终浓度(比色时) 50 mmol/L磷酸缓冲液 1.7   130 mmol/L MET溶液 0.3 13 mmol/L 750 μmol/L NBT溶液 0.3 75 μmol/L 100 μmol/L EDTA-Na2溶液 0.3 10 μmol/L 20 μmol/L核黄素溶液 0.3 2.0 μmol/L 酶液 0.1 对照2支管以缓冲液代替 总体积 3.0         五、实验结果与计算 1.将测定的数据填入下表 重复 次数 样品重量 W (g) 提取液体积 V (mL) 吸取样品液体积 Vs (mL) 560 nm吸光度值 样品中SOD活性 (U) ODC ODS 计算值 平均值±标准偏差 1               2             3                             2.计算结果 显色反应后,分别记录样品管反应混合液的吸光度值(ODS)和照光对照管反应混合液的吸光度值(ODC)。以每分钟每克鲜重(FW)果蔬组织的反应体系对氮蓝四唑(NBT)光化还原的抑制为50%时为一个SOD活性单位(U)表示。 式中: ODC——照光对照管反应混合液的吸光度值; ODS——样品管反应混合液的吸光度值; V ——样品提取液总体积,mL; Vs——测定时所取样品提取液体积,mL; t  ——光照反应时间,min; W ——样品重量,g。 也可以用以每分钟反应体系对氮蓝四唑(NBT)光化还原的抑制为50%时所需的酶量为一个SOD活性单位(U)。 六、注意事项 1.需要通过预实验,摸索显色反应所需的时间。 2.当测定样品数量较大时,可在临用前根据用量将表中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.6 mL,然后依次加入核黄素和酶液,使终浓度不变,其余各步骤与上相同。 4.要求各管受光情况一致,所有反应管应排列在与日光灯管平行的直线上。反应温度控制在25℃左右,视酶活性高低适当调整反应时间。温度较高时,光照时间应缩短;温度较低时,光照时间相应延长。 5.所用指形管要洁净透明,透光性好。用浅底广口的小玻璃皿照光效果更好。 七、思考题 1.在SOD测定中为什么设照光和暗中两个对照管? 2.影响本实验准确性的主要因素是什么?应如何克服? 十九、果蔬中过氧化物酶活性的测定 一、目的要求 了解过氧化物酶的作用,掌握愈创木酚法测定果蔬组织中过氧化物酶活性的方法。 二、基本原理 过氧化物酶(Peroxidase,POD)是果蔬体内普遍存在的一种重要的氧化还原酶,它与果蔬的许多生理过程和生化代谢过程都有密切关系。在果蔬的生长发育、成熟衰老过程、抗病、抗氧化、抗逆境胁迫中,POD活性不断发生变化。在受到外界刺激、病原菌侵染、贮藏环境变化、加工条件改变等作用时,果蔬组织中POD酶活性都会做出相应得应答反应。 过氧化物酶催化过氧化氢(H2O2)氧化酚类物质产生醌类化合物。这些化合物进一步缩合或与其它分子缩合形成颜色较深的化合物。在过氧化物酶催化作用下,过氧化氢能将愈创木酚(邻甲氧基苯酚)氧化形成4-邻甲氧基苯酚。该产物呈红棕色,在470 nm处有最大光吸收,故可通比色法测定过氧化物酶的活性。 三、材料、仪器及试剂 (一)材料 各种水果和蔬菜。 (二)仪器及用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、秒表、移液器、离心管、试管、容量瓶(100 mL,1 000 mL)。 (三)试剂 1.100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液 母液A(200 mmol/L醋酸溶液):量取11.55 mL冰醋酸,加蒸馏水稀释至1 000 mL。 母液B(200 mmol/L醋酸钠溶液):称取16.4 g无水醋酸钠(或称取27.2 g三水合乙酸钠),用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。 取68 mL母液A和432 mL母液B混合后,调节pH至5.5,加蒸馏水稀释至1 000 mL。 2.50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液 3.提取缓冲液(含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100) 称取340 mg PEG 6000(聚乙二醇6000)、4 g PVPP(聚乙烯吡咯烷酮,Polyvinyl–polypyrrolidone),取1 mL Triton X-100,用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。 4.25 mmol/L愈创木酚溶液 取320 μL愈创木酚,用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液稀释至100 mL。 5.0.5 mol/L H2O2 取1.42 mL 30% H2O2溶液(30% H2O2的摩尔浓度约为17.6 mol/L),用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液稀释至50 mL,现用现配,避光保存。 四、实验步骤 (一)酶液制备 称取5.0 g果蔬组织样品,置于研钵中,加入5.0 mL提取缓冲液,在冰浴条件下研磨成匀浆,于4℃、12 000×g离心30 min,收集上清液即为酶提取液,低温保存备用。 (二)活性测定 取一支试管,加入3.0 mL 25 mmol/L愈创木酚溶液和0.5 mL酶提取液,再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液迅速混合启动反应,同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中,置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比,在反应15 s时开始记录反应体系在波长470 nm处吸光度值作为初始值,然后每隔1 min 记录一次,连续测定,至少获取6个点的数据。重复三次。 五、实验结果与计算 1.将测定的数据填入下表 重复 次数 样品 重量 W (g) 提取液 体积V (mL) 吸取样 品液体积 Vs (mL) 470 nm吸光度值 样品中POD活性 (△OD470·min-1·g-1 FW) OD0 OD1 OD2 OD3 OD4 OD5 △OD 计算值 平均值±标准偏差 1                         2                       3                                                 2.计算结果 记录反应体系在470 nm处的吸光度值,制作OD470值随时间变化曲线,根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD470。然后,以每克鲜重(FW)果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个过氧化物酶活性单位(U),则U =△OD470·min-1·g-1 FW。计算公式: 式中: △OD470——反应混合液的吸光度变化值; △t ——酶促反应时间,min; V ——样品提取液总体积,mL; Vs——测定时所取样品提取液体积,mL; W ——样品重量,g。 过氧化物酶活性还可以每分钟反应体系在波长470 nm处吸光度值读数变化增加1时所需的酶量为1个活性单位(U),表示为U = △OD470·min-1·mg-1蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。即: 其中,C表示酶提取液中蛋白质含量(mg/mL)。这里所计算的实际上是酶的比活力,有利于减少操作过程带来的误差。 六、注意事项 1.应进行预实验。测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化,确定该酶促反应速度呈线性变化(初级反应)的时间段。这样,只测定某一段时间内反应液的初始吸光度值(OD0)和最终值(ODt)这两个数据,就可以计算每分钟吸光度值的变化量。 2.利用100 mmol/L、pH 6.0磷酸缓冲液作为提取液,可以提取多数果蔬组织中过氧化物酶。配制方法: 母液A:0.2 mol/L Na2HPO4 溶液(53.65 g Na2HPO4?7H2O或71.64 g Na2HPO4?12H2O配成1000 mL)。 母液B:0.2 mol/L NaH2PO4 溶液(27.6 g NaH2PO4?H2O或31.2 g NaH2PO4?2H2O配成1000 mL)。 分别取12.3 mL母液A与87.7 mL母液B充分混匀,调节pH值,稀释至200 mL。样品提取液中的其它成分根据需要加入。 3.在提取缓冲液中加入PEG,PVPP和Triton X-100等是为了提高酶蛋白的溶解性,减少提取过程中酶活性的损失。这些物质的具体作用可以参阅本第一篇相关内容。 七、思考题 1.果蔬组织中POD有哪些方面的作用? 2.讨论POD或性测定数据的记录与处理的特点及意义。
/
本文档为【酶活测定方法】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索