热休克蛋白 hsp70

1、热休克蛋白的发现 热休克蛋白最初是在果蝇中发现的。早在1962年Ritossa把25℃下培养的果蝇幼虫无意间置于32℃的环境中30min后在其巨大唾液腺染色体上发现了3个新的膨突,说明该区域基因转录增强,可能在热休克时有某种蛋白合成的增加。人们将该现象称为热休克反应。1974年Tissieres等用SDS凝胶电泳技术和放射自显影技术首次证明,热休克反应产生一组特殊的蛋白质,即热“休克蛋白”。近年研究表明,HSP的生成,不仅见于果蝇,而且是普遍存在于从细菌直至人类的整个生物界(包括植物和动物)的一种现象 2 热休克蛋白的分类及特性 热休克蛋白按照蛋白的大小共分为以下几个家族,分别为HSP100,HSP90,HSP70, HSP60 以及小分子热休克蛋白,每个家族各有很多成员。其中HSP70家族成员最多,共有21种蛋白质,是一组在进化上高度保守的应激蛋白。主要包括HSP68、72、73。、HSC70、GRP75、78、80、Bip等 HSP70有许多重要的生物学特性:第一、存在的普遍性,从原核生物到真核生物都有表达。第二、高度的保守性,不同来源的HSP氨基酸序列有50%-90%的同源性。第三、正常情况下HSP70在细胞内表达水平很低,只有在应急条件下,HSP70的合成才显著,以提高其本身的抗应急能力。第四、正常情况下HSP70位于细胞浆内,只有当细胞受到应急作用时,才迅速移入细胞核。 3、HSP70的表达与调控 随着研究的深入,人们发现真核生物HSP70的转录需要三个步骤:在应急条件下,如热休克,导致热休克转录因子(HSTF)的激活。活化的HSTF与HSP70基因的HSE区域结合,从而诱导基因的转录。HSTF是一种蛋白质,HSE是位于HSP70基因启动子TATA盒上游的一段保守序列,具有增强子的一些特性。HSP70可作为 一种负性调节物来调节HSP的表达:在正常情况下HSP70蛋白与HSTF结合,以单体的形式存在,此时HSTF的活性被抑制,不具有与HSE结合的能力。热应急条件下,细胞内大量增加的非稳定蛋白等与HSP70有高度的亲和力,可竞争性地结合HSP70使大量的HSTF游离出来,形成三聚体,进入细胞核【1】]。HSTF三 聚体与HSE快速、高效地结合,保证HSP基因的高效转录,从而HSP70蛋白的合成增多。当产生的HSP70的水平到一定量,足够结合HSTF的时候,使其活性降低,从而关闭热休克基因的表达. [1] 陈劲松. 热休克蛋白的分子遗传学研究进展[J ] . 国外医学一遗传学分,2001 ,24 (3) 128 - 132. 正常情况下HSP70的mRNA很不稳定,半衰期很短,只有20min左右,而在热应激下可长达几个小时之久。HSP70 mRNA常温下的不稳定由mR2 NA降解系统控制,而热应激影响了系统的活性[ 2 ]。热应激下细胞内其他的mRNA虽不被降解,但翻译停止,HSP70mRNA大量翻译。 [2] 孙克年 .能提高牛乳品质的饲料添加剂 [J ].《中国奶牛》 4 热休克蛋白70家族的功能 4.1分子伴侣功能 分子伴侣,是一类帮助新合成或解折叠蛋白质正确折叠和成功组装而本身非最终装配产物的组成蛋白,HSP70是目前发现的主要的分子伴侣之一,在细胞内分布 最广,含量最大.HSP70主要从以下几个方面发挥其分子伴侣功能:一是保持新合成蛋白的恰当构型,防止在正确的多聚体形成之前的错误折叠或聚集,二是帮助蛋白质分子的跨膜运输,三是促进受损蛋白的恢复或降解,以维持细胞的功能. HSP70发挥上述功能可能与HSP70自身ATP酶结构域或者G末端的EEVD序列有关[3] .HSP70以 ATP依赖的方式结合未折叠多肽疏水区以保持其状态,再通过有控制的释放帮助其折叠,细胞内很多蛋白质合成后暂时与HSP结合 ,保持其伸展状态以利于穿过内质网或线粒体膜[4]。 [3]Mosser DD,Caron A W and Bourget L. The Chaperone Function of hsp70 Is Required for Protection against Stree-Induced Apoptosis [J].Mol. Cell Biol.,2000; 20: 7146-7159. [4] 李永和.牛奶成分的营养调控[J ].《中国乳业》 4.2提高细胞的耐受性 HSP70广泛存在于细胞中,与核仁和细胞膜结合,从而提高细胞对热的耐受力,它可以维持细胞内的稳态它在细胞内的高表达可以显著改善细胞的生存能力。例如,长期耐力试验后运动肌群中的HSP70含量明显提高【5】。再如,微量注射HSP70单克隆抗体后细胞的热耐受性明显降低【6】。王枫等人用硫酸镉诱导细胞HSP70高表达,发现1小时后细胞HSP70 mRNA水平显著升高;且其水平在一定程度与细胞耐受力呈正相关【7】。由此可见,HSP70在细胞保护方面起着不可磨灭的作用。 [5] Currie RW. Tanguaru RM. Kingama JG. Heat-shock response and limitation of tissue neerosis during occlusion/reperlusion in rabbit hearts [J.Circulation. 1993.87(4):963-971]. [6] Riabowol KT. Mizzen IA. Welch WJ. Heat shock is lethal to fibroblasts microinjected with antibodies against HSP70 [J].Science. 1998.242(3)433-436 [7 ] 王枫,郭俊生. HSP70 高表达对K562 细胞耐热力的影 响[J ] . 中国公共卫生,2000 , 16 (7) :587 - 588. 4.3 抗细胞凋亡作用 研究发现当机体处于不利条件下,如热应激能引起自身细胞的程序性死亡,即“细胞凋亡”。在1997年,Cabai发现细胞内HSP70水平的增高可以减少细胞的凋亡,原因是阻断了信号通路从而抑制应激诱导的应激激酶的活性【8】。 [8 ] Cabai VL , MerimAB ,MosserDD. et al . HSP70 pre2 vent s activation of st ress kinase ,A novel pathway of cellular ther motolerance [J ] . J Biol Chem ,1997 ,272 (29) :18033 - 18037. 4.4抗氧化作用 在应急条件下氧自由基增多,可使脂质氧化并且影响细胞膜系的通透性和流动性,从而对细胞及细胞器如线粒体、叶绿体等产生破坏。超氧化物歧化酶(SOD)能将氧自由基歧化呈无毒的水,从而解除SOD对细胞的毒害作用。HSP70可以激活蛋白激酶C,增强蛋白酶的活性从而促进ATP 水解,刺激生成SOD. 5、HSP70与气道慢性炎症 在气道慢性炎症中,粘液的过度分泌显著加大了疾病的发生率和死亡率,成为重要的危害因素之一。黏蛋白(MUC ) ,是黏液的主要成分。而HSP70参与MUC的分泌过程,从而了解了HSP70 在气道慢性炎症中的作用机理,可为气道慢性炎症性疾病提供新的治疗方向【9】。 HSP70通过上调TNF2α诱导MUC表达,研究发现发现HSP70可诱导TNF-α表达增加, TNF-α在慢性气道炎症黏液高分泌中也作为重要的炎症因子促进MUC的表达。首先,TNF-α通过一系列途径途径激活转录因子Sp21 而促进MUC2 和MUC5AC基因转录[10 ]。TNF-α也能反式激活EGFR诱导MUC5AC基因表达增加[11 ]此外, TNF2 α还可在转录后水平调节MUC 基因 [10 ] Kohri K, Ueki I F, Nadel J A, et al. Neutrophil elastase induces mucin p roduction by ligand2dependent ep idermal growth factor re2 cep tor activation[ J ]. Am J Physiol Lung CellMol Physiol, 2002, 283 (9) : L5312L540. [11] Lee CW, Lin CC,LinWN, et al. TNF2alpha inducesMMP29 ex2 p ression via activation of Src /EGFR, PDGFR /PI3K/Akt cascade and p romotion of NF2kappaB /p300 binding in human tracheal smooth muscle cells [ J ]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2007, 292 (3) : L7992812. HSP70还通过上调IL28从而影响气道炎症及气道黏液高分泌【12】研究发现在气道损伤时, HSP70 会被释放到气管内,并激活固有的或者特异性免疫应答。Chase 等[ 13 ]利用外源性重组HSP72刺激人气道上皮细胞,结果发现HSP72可上调IL28的表达。IL28可募集并活化中性粒细胞,通过释放活性氧和TGF2β,从而加强EGFR 信号通路,导致MUC表达。最后HSP70还可最为分子伴侣参与MUC的分泌过程 [ 13] ChaseMA, WheelerDS, Lierl KM, et al. Hsp72 induces inflam2 mation and regulates cytokine p roduction in airway ep ithelium through a TLR42 and NF2kappaB2dependent mechanism [ J ]. J Im2 munol, 2007, 179 (9) : 631826324. 6、HSP70抗肿瘤细胞凋亡作用 细胞凋亡是细胞的程序性“自杀”过程。HSP70家族对细胞凋亡起到了保护的作用。HSP70 作为分子伴侣在肿瘤细胞中优先大量表达,保护肿瘤免受大面积凋亡和坏死 [14 ] [14] Nylandskd J ,Brank K,J aattela I , et a1. Heat shock protein 70 is required for the survivallf canncer cell [J ] . Ann N YA cad Sci. 2000 ,926 :122 - 125. 据报道以腺病毒为载体将反义HSP70 基因转染到肿瘤细胞中可减少HSP70 的表达导致肿瘤细胞凋亡[15 ] [ 15 ] Dresses R ,Dlsner L ,Quentin T , et al. Heat shock protein 70 is able to prevent heat shock - jnduced re2 sistance of t ragel cells to CTL [J ] . J Immunol ,2000 , 164 (5) :2362 - 2371. 但HSP70 对于肿瘤细胞的作用十分复杂的在有些条件下,HSP70具有促肿瘤细胞凋亡的作用,。Dressel R 等发现用鼠HSP70 基因转染人类黑色素瘤细胞后导致HSP70过表达,促进了CTL 介导的肿瘤细胞凋亡[16 ] [ 16 ] Iosser D ,Caron AW ,Bourgert L ,et al. The chaperone function of HSP70 is required for protection againstst ress - induced apoptosis[J ] . Mol Cell Biol ,2000 ,20(19) :7146 - 7159. 6、HSP70与脑缺血 6.1脑缺血后HSP70的调节及脑保护机制 在脑缺血缺氧等应激条件下,由于A TP 严重缺乏,HSP70 的同系物Ssb 与HSF聚合生成HSF/ HSE 复合物,使得HSF 无法游离, 最终导致HSP70 基因转录减少,故只有在供血情况下才可调节HSP70 mRNA 的转录。同时由于缺少必要的能量物质基础导致HSP70 在缺血核心区表达被抑制。 大量的实验表明,HSP70 的高表达增加了神经细胞对缺血产生代谢压力的抵抗力。HSP70主要是通过对抗内源性损伤因子的毒副作用来 提高对脑的保护。Choi 等[17 ] 通过基因敲除小鼠的实验发现HSP70 的表达可增加SOD的活性,从而减少氧自由基对脑的损害。 [17] Choi S , Park K A , Lee H J , et al . Expression of Cu/ Zn SOD protein is suppressed in hsp 70. 1 knockout mice. J Biochem Mol Biol , 2005 , 38 : 1112114. Lai 等[18] 发现, HSP70 能阻止兴奋性氨基酸与其受体结合,从而 减少了对脑细胞的毒性作用。 [18] Lai Y, Du L , Dunsmore K E , et al . Selectively increasing inducible heat shock protein 70 via TAT2protein t ransduction protect s neurons f rom nit rosative st ress and excitotoxicity. J Neurochem , 2005 , 94 : 3602366. 此外 HSP70对脑的保护作用还通过其分子伴侣作用和抗细胞凋亡来实现的 6.2 HSP70 转基因治疗 治疗脑缺血的方法有很多但目前主要都是药物治疗,但传统的药物治疗有很多缺陷,很多药物难以透过血脑屏障发挥作用,但通过HSP70 转基因治疗可以克服这些缺点。基因治疗被认为是将来最有希望的治疗脑缺血的方法之一。Lee 等[19]用转猪HSP70β基因小鼠来实验,结果发现转基因小鼠多器官内HSP70 的合成减轻了热休克引起的高热、循环休克及脑缺血损伤程度。van der Weerd 等[20] 对大脑中动脉永久缺血后的HSP70 过表达的转基因小鼠与野生型小鼠进行MRI 对比研究,同样说明了转基因小鼠对脑缺血的损伤程度较轻。现在为止,基因治疗虽然被认为是将来最有希望的治疗脑缺血的方法,但目前仅在动物实验中取得一定成果,应用于临床仍有待进一步研究。 [19]Lee W C , Wen H C , Chang C P , et al . Heat shock protein 72 overexpression protect s against hypert hermia , circulatory shock , and cerebral ischemia during heat st roke. J Appl Physiol , 2006 , 100 : 207322082. [20]van der Weerd L , Lyt hgoe M F , Badin R A , et al . Neuroprotective effect s of HSP70 overexpression after cerebral ischaemia2an MRI study. Exp Neurol , 2005 , 195 : 2572266.