检验方法确认程序

检验方法确认程序 一．目的：适应医学技术的发展，确保检验方法准确可靠，以满足临床需要。 二．适用范围：实验室所有开展的检验方法。 三.工作程序： 1．实验室必须使用能保证准确和可靠的检验结果的检验方法、器材、仪器、试剂、质控品和校准品、供应品。 2．必须选择能保证检给结果在实验室所确定的方法性能规格内的方法。在标本前，实验室必须对使用方法的下述的性能规格进行确认：准确度、精密度。如有必要，可添加特异性和灵敏度，以及检验结果的报告范围、参考值以及其它适合的特性。 2．1．实验室引进我国注册登记的国外方法（试剂盒）或我国取得生产许可证和方法（试剂盒）时，在报告检验结果前，必须得到下列特性的性能规格：准确度、精密度、检验结果的报告范围（或者线性）、参考值。实验室至少应检查其准确度、精密度。必要时增加特异性和分析灵敏度，以及报告范围，参考值是否符合本实验室的服务人群等。如与厂商提供的数据进行比较，应取得相符结果。 2．2．实验室自行建立的方法，在报告结果患者前： 2．2．1建立每一方法的性能规格，包括：准确度、精密度、特异性、干扰因素的影响、分析灵敏度、检验结果的报告范围（或者线性）、参考范围、其它需要检测的性能。 2．2．2．建立该方法的校准程序和ICQ规则。 2．3实验室必须有上述活动的和文件。并保存到停止到使用这些方法后半年。 3．实验室必须有与所做检验的专业和工作量相适应的，足够的器材、仪器、试剂、质控品和校准品、供应品。 4．实验室必须确定正确制备、储存和使用上述体外诊断用品的条件。 4．1．这些条件包括：水的质量、温度校准。保护器材和仪器，不致由于电流的波动各中断引起对检验结果的不利影响。 4．2．必须将纠正由于达不到规定所采取的改正措施文件化。 5．用商品试剂盒时，对于国家规定应有生产许可证，注册登记证的品种，决不能使用没有生产许可证、注册登记证的商品试剂盒。尚未规定者，生产厂家应提供该产品性能规格以及质量保证书。 6．试剂、溶液、培养基、校准品、质控品和其它供应品，必须加以标记，标记上应有： 6．1．识别名：当有意义时应标明浓度，效价，滴度等 6．2．储存要求 6．3．制备日期和失效期 6．4．其它与正确使用有关的信息 7．应根据仪器制造商说明或依据权威机构的要求来选择和使用校准品和质控品。实验室自行选用的校准品或质控品，应有实验依据证明其不影响检验结果的准确性和可靠性。 8．当试剂、溶液、培养基、校准品、质控品或其它供应品超过其失效期，可能已经变质或者质量不合格时，不能使用。只有当生产厂家或权威机构出具书面证明或者实验室有充足依据证明其不影响检验结果的准确性和可靠性，方可在规定的延长期间使用。 9．除非有生产厂家说明，不同批号试剂盒中成分不能相互交换。 10．实验方法的评价 10．1．准确度的评价 准确度是指测定结果偏离真值的程度，它与系统误差的随机误差合成的大小相对应，，其含义乃是不准之意。 在实际测量过程中，往往需要做几次平行测定。精密度是指测定结果偏离平均值的程度，常用偏差来表示： 算术平均误差　 偏差 其中为单次测定值，为多次测定值的平均值，n为测定次数。精密度又称精度，精度这个词也常用作泛指性的广义名词。例如：实验相对误差为0.01，则常笼统说精度为10-4。如果是由系统误差与随机误差共同引起，则可说其准确度为10-4。 精密度高只是准确度高的必要条件，而不是充分条件，不能说精密度高则准确度一定高。 10．2精密度评价 1、精密度的内容：精密度通常用不精密度表示，精密度评价的目的是评价检测设备的总不精密度，是设备在一定时间内的变异性。许多变异源可在不同程度上影响设备的精密度，通常在进行精密度评价时要充分考虑所有影响总不精密度的来源，但不必去评价每个来源的相对大小。用于描述与时间相关的不精密度的内容包括：批内、批间、日内和日间不精密度。其中，批内不精密度和总不精密度的内容最为重要。 2、一般实验要求：为减少对结果的影响因素，全部实验过程中应使用单一批号的试剂和校准物。实验样本可采用稳定化、蛋白基质、可模拟临床样本特性的产品，必要时，可采用稳定化的混合冷冻血清。选择样本浓度时应考虑医学决定水平，推荐使用2个或以上浓度的样本。 3、实验程序：精密度评价实验应在操作者完全熟悉实验过程和评价以后（通常需要5天时间）进行。每天分2批测定样本，各批实验间至少间隔2小时。每批测定2个浓度样本，每个样本重复测定2次。按表1记录实验结果。 4、结果计算（略） 10．3测定线性范围评价 线性是分析方法的一个特征，不同于准确度和精密度。线性范围（LinearRange）是指系统最终的输出值（浓度或活性）与被分析物的浓度或活性成比例的范围。线性范围的测量即测定浓度曲线接近直线的程度，它反映整个系统的输出特性。线性检验系统反应，包括校准、线性化技术、系数和仪器反应。 一般要求：执行分析过程的实验人员必须掌握仪器操作和维护程序、样本准备方法和校准。对较简单的设备需要5天或更少的时间，对较复杂的多通道设备需要5天或更长的时间。在完成仪器熟悉过程后开始实验并收集数据。 实验样本：线性实验应使用与病人样本相似的样本或注明样本的基质类型，最少使用4个浓度水平，推荐5个水平。高值样本应高于线性上限30%，低值样本应低于线性低限。线性实验可使用的样本包括：混合病人血清（理想的样本基质）、加入待测物的混合人血清（加入品在没有干扰物存在时不需高纯度）、对特殊材料透析过的混合人血清（用于降低分析物浓度，如：透析、热处理、层析）、对盐水透析过的混合血清（在线性实验中使用此类样本可掩盖不同的基质效应）。商品质控物或校准物（此类样本由于不是正常的生理形式，可掩盖实际的线性结果）、水溶液（一般无基质效应），等。 实验程序：全部实验和数据采集应在同一工作日内完成。分析序列应为随机排列。有显著携带污染时，应用空白隔开样本。每个浓度样本重复测定4次。记录测定结果。 结果分析：观察结果有无明显的数据错误，若有明显异常时，应判断是否为离群点。对于特定浓度Yi值的离群点进行检验时，需将其4个重复值从大到小排列（Yi-1到Yi-4）。计算极差D=Yi-1-Yi-4。若Yi-1可能是离群点，计算：D1=（Yi-1–Yi-2）/D。若Yi-4可能是离群点，计算：D4=（Yi-3–Yi-4）/D。计算结果（D1或D4）如果大于0.765(0.05)或0.889(0.01)，则该点判为离群点。全部数据中的离群点如果有2点或以上，则应保留全部数据或重新进行实验。 以分析物浓度为X轴，反应值或仪器输出值为Y轴，绘制X-Y线性图。目测线性和进行统计学分析，判断是否符合要求。 对于线性结果的分析，应当注意统计学标准和临床可接受限不同；应慎用方法学线性范围从0开始；有临床意义的浓度应在线性评价中，如最低线性浓度、医学决定水平及最高线性浓度。 10．4．方法学比较 临床实验室中使用的检验方法，随着科学技术的发展不断更新，在引进新方法前或用一种方法替代另一种方法时为保证临床实验室检验结果的连续性，通常要进行偏差分析，以比较不同的分析方法在测定同一分析项目时结果的差异。 1、样本要求：用于方法学对比实验的样本，应来源于健康人或患者，无明显干扰因素，并应尽量避免使用贮存样本。全部样本在医学决定水平范围内均匀分布，样本至少40例，增加可提高可信性。 2、对比方法：可采用厂家要求的实验室常规方法或公认的参考方法。对比方法应具有好的精密度，没有已知的干扰物，与评价方法单位相同，相对国家标准或参考方法的偏差为已知。 3、实验程序： a)操作者应有足够的时间熟悉仪器操作，保养程序及评价方案。在全部实验过程中，都必须建立适当的质量控制程序。 b)进行方法学对比实验，每天应测定8份样本，每份样本都用评价方法和对比方法进行双份测定，至少连续测定5天，共40份样本。测定时先对样本排序，再按顺序1至8测定第一次，顺序8至1测定第二次。按表3收集实验数据 c)结果绘图：实验结果可绘制4张图，第一张图是Yi对Xi的均值散点图，第二张图为Yij对Xi散点图，第三张为（Yi-Xi）对Xi偏差图，第四张为（Yij-Xij）对Xi的偏差图。 11．方法建立时的条件选择 在方法建立的原理确定后，尚需根据其原理来选择合适的条件，以保证所建的方法可靠。下面以光度法为例介绍其条件选择的主要环节。颜色反应是光度分析的基础，因此，用作光度测定的颜色反应至少要具备以下几条：反应有较高的特异性，从而干扰小；反应产生的有色物质吸光系数要大，大者灵敏度高；有色产物的离解度要小，小则稳定；此外，还要求有色产物有恒定的组成成分，使产生的颜色稳定。由于影响颜色反应的因素很多，如温度、pH、试剂浓度、反应的时间等等。这些因素在建立新方法时都要逐项试验，确定最佳实验条件。 11．1．选择合适的吸收光谱 实际上就是测定颜色反应产生的光吸收曲线。方法是在整个可见光区（400-700nm）以10nm（在接近最大吸收波长范围还应再细分）间隔。分为十几个点测定其在不同波长时的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，波长为横坐标绘成光吸收曲线。在条件许可的情况下，应采用双光束分光光度计在可见光区进行波长扫描，结果较为可靠。同时，还应以同法分别测定其空白液和标准物颜色产物的吸收曲线。测定光吸收曲线的目的是找出最大吸收波长，作为光度法波长选择的依据。因为在最大吸收波长测定，可获得最大灵敏度，且能更符合比耳定律。然而在实际使用中，不能单纯考虑灵敏度高，还要考虑在测定浓度范围能否符合比耳定律，并能在光度计准确区域内（吸光度0.2-0.85之间）读出读数。有时由于测定的最大吸收波长并不是所要测定物质的特性吸收波长，即同时存在具有相似最大吸收的干扰物质，为了保证实验的特异性，常改用特有而非最大吸收波长进行测定。例如用磷钼酸测定血糖，选用波长420nm，溶液对此波长的吸收比其它波长光线的吸收都低，其目的是使参考值有一个较低的吸收，这样可允许在相同情况下对高出参考值的血糖也能得到准确的读数。因为在这项测定中，高血糖是常见的变化方向。 11．2．测定方法适用的浓度范围 根据光吸收定律，溶液的吸光度应与溶液的浓度成正比。但由于有色物质的电离、水解、缔合等原因当溶液稀释或增浓时，有色物质颜色的深浅并不按比例降低或增高，因而也就不符合光吸收定律。测定方法适用的浓度范围是指分析的浓度范围在直线线性段，浓度与吸光度之比为一常数，此时直线上任何一点的斜率tanθ相等，即： tanθ＝A1/C1＝A2/C2＝A3/C3＝……＝An/Cn＝K 此处K即为校正常数，可用于结果计算。 通常稀溶液都是符合比耳定律的，但在浓度过高和过低时往往都不呈直线，说明低浓度部分亦有仪器的灵敏度和方法的检测能力限制，所以，具体的测定就宜选择在直线段浓度范围内进行。以此还可用于确定标本的用量，使具有临床意义的标本测定结果都落在直线范围内。