功能学实验家兔弥散性血管内凝血(DIC)

功能学实验家兔实验性弥散性血管内凝血实验 一．实验目的 应用静脉注射兔脑浸液方法，复制家兔实验性 DIC。通过实验和几项血液学指标的测定及结果分析，了解实验室诊断 DIC 的常用方法。并且联系理论知识加深理解 DIC 的病因及发病机理。 二．实验动物 未知性别家兔（实验室提供）一只。 三．实验过程 1.家兔于仰卧位固定，颈部剪毛，在颈部皮下注射局麻药1%普鲁卡因约5ml，行局部麻醉。 2. 用剪刀颈部切开皮肤，钝性分离皮下组织，暴露气管后往外侧拉开切口边缘的皮肤及下方的肌肉组织，找到颈动脉并用玻璃分针分离，行颈动脉插管。 3. 第一次采集血标本：预先向10ml离心管中注入0.5ml3.8％枸橼酸钠溶液。再打开血管夹，从颈动脉插管放血 4.5ml，立即反复颠倒混匀（切忌振荡混匀），待离心。向动脉插管中回推生理盐水，夹好血管夹。 4. 复制 DIC 模型：抽取 2％兔脑浸出液10ml于注射器中，经耳缘静脉缓慢推注，注入速度为每分钟 2ml以下。同时密切观察家兔反应，如出现呼吸急促，烦动不安，当即停止注射，迅速进行第二次采血。若注射完后家兔未挣扎，则在注射后计时2min，2min后进行第二次采血。采血方式与第一次采血相同。 5. 将前后两次所得的抗凝血，经 3000rpm离心5min，将上层血浆清液分别吸至两支清洁试管中，切忌吸入细胞成分，并作好标记备用。其中一支试管吸入0.5ml血浆，另一只试管尽量吸取剩下的血浆。 6. 血浆鱼精蛋白副凝固试验（3P实验）：向吸取0.5ml血浆的两支试管中加入1%鱼精蛋白溶液50μl，轻轻摇匀后，在37℃水浴15min。取出试管，在灯光下对黑色背景一边晃动试管一边观察，溶液清澈者为阴性，出现絮状沉淀或胶冻状物为阳性。 7. KPTT, PT, TT, FIB实验：剩余两支试管使用凝血仪测定KPTT, PT, TT和FIB，并记录数据。 四．实验药物及器材 实验药物：2％兔脑浸出液（临用前配，并在37℃保存），1％普鲁卡因溶液，3.8％枸橼酸钠溶液。生理盐水，1％鱼精蛋白溶液。 实验器材：兔手术台，手术器械，37℃电热恒温水浴箱，离心机，刻度离心管（2 支），试管（5支），移液器（100μl，1000μl），纱布。 五．实验结果 1、实验现象记录 家兔皮下注射局麻药后，在皮下形成鼓包，经按摩揉动数分钟后，鼓包仍存在，局麻药未完全吸收。经家兔耳缘静脉缓慢推注兔脑浸出液后，家兔表现较平静。推注完成后计时2min27s时家兔出现呼吸急促，燥动不安，欲挣脱动作，此时进行第二次采血，并离心，进行各项指标测定。家兔在第二次采血后，又重新恢复平静，呼吸正常。一小时后家兔仍未死亡。 2、测量指标记录。 组别 KPTT(s) PT(s) TT(s) FIB(g/L) 3P 正常 13.5 6.5 10.6 1.949 阴性 DIC 18.2 7.0 12.9 2.09 阴性             六．讨论 1.静脉注射兔脑浸液引起DIC的原因和机制 兔脑浸液属于组织因子，大量的兔脑浸液静脉注射后，可激活家兔的外源性凝血系统，启动凝血过程，依次激活凝血因子FIX, FVIII, FX等，激活凝血酶，从而使血小板聚集和纤维蛋白原变为纤维蛋白，促进凝血。另外，凝血酶激活后反馈性激活FIX, FX, FXI, FXII等，扩大凝血反应。此即为高凝期，微循环易形成广泛的微血栓。 大量凝血酶的激活和微血栓形成，使血液中凝血因子和血小板被大量消耗，同时可能继发性激活纤溶系统，导致凝血系统与纤溶系统不平衡，血液处于消耗性低凝期，此时机体有明显出血症状。 DIC时产生的大量凝血酶和FXIIa等激活纤溶系统，产生大量纤溶酶，导致纤溶亢进，大量纤维蛋白降解产物形成，具有明显的抗凝作用，称继发性纤溶亢进，此时机体出血十分明显。 2. KPTT、PT、TT、Fg和3P实验的原理、临床意义以及在本实验中发生变化的原因和机制。 （1）KPTT实验是在血浆中加入KPTT试剂（包括接触因子激活剂和部分磷脂）以及钙离子，观察血浆发生凝固的时间。由于在37℃时，以接触因子激活剂可以激活凝血因XII和XI，从而激活内源性凝血通路。另外，以部分凝血活酶脑磷脂悬液代替血小板提供凝血的催化表面，在Ca2+参与下，实现凝血。这样消除了血小板对凝血的影响，最后凝血时间仅与内源性凝血通路中的凝血因子活性有关，可以筛查内源性凝血通路是否正常。 实验中，由于家兔DIC时，外源性凝血通路激活的凝血酶可以反馈性激活FXI, FXII，导致内源性凝血通路中的凝血因子被消耗。因此KPTT延长。 （2）PT是在血浆中加入过量的组织凝血活酶浸出液和钙离子，使凝血酶原转化为凝血酶，从而激活外源性凝血途径，使纤维蛋白原转变为纤维蛋白即发生凝固；其凝固时间的长短是反映血浆中凝血酶原、外源性凝血因子V, VII, X以及纤维蛋白原的水平。 实验中，由于家兔注入大量组织因子，外源性凝血通路激活，导致凝血酶原、外源性凝血因子以及纤维蛋白原均被消耗，因此PT时间延长。 （3）TT实验是在血浆中加入标准化的凝血酶溶液，测定血浆凝固需要的时间，又称为血浆凝血酶时间。由于凝血酶在血浆中主要使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进凝血。因此TT主要与抗凝血物质和纤维蛋白原含量有关。 实验中，外源性凝血通路激活后消耗大量纤维蛋白原形成血栓，而且继发纤溶亢进，因此血液中纤维蛋白原含量降低，抗凝物质增多，造成TT延长。 （4）FIB实验是在血浆中加入定量的凝血酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白，从而使血液凝固。通过测量血浆凝固的时间来计算纤维蛋白原含量。 实验中，外源性凝血通路激活后消耗大量纤维蛋白原形成血栓，理论上血浆纤维蛋白原含量应该降低。但实际上观察到DIC后采血得到的血浆纤维蛋白原含量反而比实验前血浆要略高，可能与吸取DIC血浆样本时，由于吸入少量细胞，在检验时细胞破坏释放蛋白质，从而影响结果；或者由于血浆中含有异形球蛋白，影响了实验中血浆凝固。 （5）3P实验用于测定血浆中纤维蛋白单体（sFM）含量。在DIC继发性纤溶亢进期，由于纤溶系统激活，产生大量纤溶酶。纤溶酶大量降解纤维蛋白多聚体，产生大量FDP。FDP与sFM在血浆中可形成可溶性复合物，不会降解。加入鱼精蛋白后，可溶性复合物解离，游离出的FM便会相互聚合形成不溶性的肉眼可见的颗粒状、絮状或胶冻状沉淀，因此可观察到阳性反应。 实验中，由于DIC激活外源性凝血通路，导致大量纤维蛋白原形成纤维蛋白单体及多聚体，因此3P实验应该可见沉淀，呈阳性。到实际上未能观察到阳性反应，可能为采血时家兔已处于DIC中晚期，sFM也在纤溶酶的作用下降解成FDP，而3p实验要求较大分子量的FDP或sFM，因此未能形成沉淀。 七．实验结论 经实验现象及理论分析，在DIC时KPTT、PT、TT均延长，FIB含量降低；3P实验仅适用于DIC早期检测，DIC中晚期可呈阴性。