浙江师范大学本科毕业
(
)开题报告
学 院
化学与生命科学学院
专业
生物科学
学生姓名
付文佳
学号
05260204
指导教师
杨莉
职称
副教授
合作导师
职称
论文题目
肉蜜柚突变体及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离
一、选题背景和意义
类异戊二烯是自然界中分布广泛的一类化合物,目前已知的类异戊二烯化合物有23,000多种。类胡萝卜素是其中较为重要的植物色素,不仅参与光合作用和光保护,还赋予根、叶、花和果实等多彩的颜色,使之具有较大的经济价值和观赏价值。除此之外,类胡萝卜素中一些代谢中间产物还具有较高的营养和保健价值,如番茄红素能预防心脏病和多种癌症、减缓动脉粥样硬化、保护心血管、抗老化、保护皮肤等;-胡萝卜素是维生素A原,维生素A缺乏会引起夜盲症等多种疾病的发生。
1998年福建省科学院果树所研究人员在平和县小溪镇琯溪蜜柚园中发现果实汁胞呈红色的芽变单株,命名为红肉蜜柚[19]。红肉蜜柚是继强德勒红心柚、丰都红心柚等之后发现的又一红近年来,包括番茄红素和-胡萝卜素在内的植物类胡萝卜素代谢途径的主要成员、关键酶及其基因已基本明确[1-4]。应用类胡萝卜素合成途径中相关基因的转基因研究也取得了较大进展,“黄金稻米”就是最成功的例子[5]。然而,由于植物合成类胡萝卜素的生物调控机制还未完全阐明,在应用遗传
技术调控植物类胡萝卜素代谢时还存在较大盲目性。例如,Ye等[6]与Romer等[7]分别向水稻和番茄中导入类胡萝卜素合成途径相关基因,并未获得预期中高水平的番茄红素积累,却导致靶器官中农业-胡萝卜素含量增加。由此可见,为减少类胡萝卜素遗传工程中的盲目性,阐明植物体内类胡萝卜素代谢相关基因表达调控机制十分必要。
肉柚类突变新品种,不仅保持了亲本琯溪蜜柚所具有的优良栽培经济性状,而且果实因积累番茄红素和-胡萝卜素而呈现红色[20]。
本实验中拟分离红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果实PSY基因全长,比较分析二者序列是否存在差异,以期了解PSY基因在突变体中的具体功能,为解释红肉蜜柚发生变异机制提供理论基础。
二、国内外研究现状、发展动态
积累类胡萝卜素代谢中间产物突变体的发现,为研究高等植物类胡萝卜素代谢调控机制研究提供了宝贵的种质资源。20世纪80年代,委内瑞拉境内发现了果肉呈粉红色的甜橙芽变品种-红肉脐橙,番茄红素是其特征色素[8,9]。国内外研究人员分别以红肉脐橙为试材研究类胡萝卜素代谢机制,获得以下研究结果:(1)红肉脐橙和普通脐橙PSY基因只有1个氨基酸残基差异,导致红肉脐橙白皮层中PSY基因的表达丰度更高;(2)LYCB基因的特异表达与果肉积累番茄红素无显著相关,LYCE基因可能对红肉脐橙番茄红素的积累产生部分影响;(3)红肉脐橙果肉DXS(5-磷酸脱氧木酮糖合成酶)、DXR(5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶)、PDS和PSY基因表达丰度均高于普通脐橙,红肉脐橙积累高含量的类胡萝卜素可能是多基因协同作用的结果[2,10-15],其结论与模式植物番茄果实积累番茄红素的机理[16-18]不尽相同。Liu等对积累番茄红素的另一甜橙芽变系“红暗柳”果实分析发现:汁胞中番茄红素积累机制与番茄相似,番茄红素合成上游相关基因PSY、PDS、ZDS和CRTISO表达水平增强,代谢下游基因LYCE表达丰度在果实成熟时快速下调;白皮层和囊衣中类胡萝卜素合成相关基因表达模式与汁胞显著不同,表明“红暗柳”果实中可能存在两种不同的调控番茄红素积累的机制,并猜测白皮层和囊衣中积累的番茄红素可能主要是由汁胞合成且转运而来[3]。
1998年福建省农业科学院果树所研究人员在平和县小溪镇琯溪蜜柚园中发现果实汁胞呈红色的芽变单株,命名为红肉蜜柚[19]。红肉蜜柚不仅保持了亲本琯溪蜜柚所具有的优良栽培经济性状,而且果实因积累番茄红素和-胡萝卜素而呈现红色,对消费者具有特殊的感官吸引力,成熟期更是提早了20-25天,具有较好的推广应用前景[20]。
但自1998年发现红肉蜜柚突变系以来,仅有陆修闽等[21]和徐娟等[6]分析了果实中类胡萝卜素的组成与含量,并未从分子水平对其高积累番茄红素与β-胡萝卜素机理进行研究。Fanciullino等[22]应用RFLP和SSR分子标记,根据类胡萝卜素代谢相关基因的表达序列对25种不同基因型柑橘进行聚类分析,发现柚类与甜橙、柠檬等位于系统树上不同的分支,而与酸橙、葡萄柚等聚类在一起,并认为LYC(LYCB和LYCE)等位基因多态性现象是引起柑橘种间类胡萝卜素组成及含量存在差异的主要原因,而与报道中起重要作用的基因PSY、BCH和ZEP(玉米黄素环氧酶)不相关,暗示红肉蜜柚的突变机制可能与红肉脐橙不相同。
鉴于红肉蜜柚优良突变株选育出时间不长,仍有许多问题尚不清楚,这些问题的解决,对于加快我国柚类品种成熟期结构、品质结构调整优化将发挥积极的推动作用。
三、研究的
及可行性分析
研究的内容:
①分别提取红肉蜜柚及亲本琯溪蜜柚果肉RNA;
②采用试剂盒逆转录合成cDNA;
③采用PCR法扩增PSY基因片段。
可行性分析:
本实验是符合研究要求的基础性实验,是科学可行的。本次实验是在全面的准备工作之后,所进行的具有实际意义的实验。
四、论文拟解决的关键问题及难点
本论文需解决的关键问题是:提取到完整的、高质量的RNA。提取到完整的、高质量的RNA是进行分子生物学方面研究的必要前提,也是使后期实验能顺利进行的重要保证,导致提取失败的原因有:
①植物组织中存在的多糖、酚类、蛋白质以及其他一些次级代谢产物往往给RNA提取带来困难,当研磨是这些物质释放出来与RNA相互作用;
②本实验所用的样品多糖含量比较高,其理化性质和RNA的很相似,在沉淀RNA,多糖和RNA会一起形成难溶于水的胶状沉淀;而在去除多糖的同时RNA也被带走,是RNA的得率大大降低;
③外源RNA酶的污染:试剂,器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统; 内源RNA酶的污染:抑制剂失效或者用量不够,实验样品过多;匀浆时温度过高。
五、研究方法与技术路线
1研究方法:
①果肉RNA的提取:参照徐昌杰等建立的适于柑橘果实RNA提取[23];
②逆转录:参照上海奇康生物公司逆转录试剂盒方法进行;
③基因克隆:根据NCBI网站提供的柚PSY基因序列设计引物,以合成的cDNA为模板,采用高保真Taq聚合酶进行PCR扩增,最后连接到T载体上,验证、送公司测序。
2.技术路线:
总RNA的提取
↓
紫外分光光度计及电泳分析RNA质量
↓
逆转录获得cDNA
↓
以cDNA为模板PCR扩增
↓
PSY基因序列的克隆、测序及分析
六、论文的进度安排
2009年1月初-2009年1月中:确定研究方向、论文题目,撰写开题报告;
2009年1月末-2009年2月初:查阅相关的资料,撰写文献综述,设计实验,检
验仪器、确定实验过程、预实验;
2009年2月初-2009年2月末:总RNA的提取,完成部分论文内容;
2009年3月初-2009年4月末:完成PSY基因的分离与结果分析部分;
2009年5月初-2009年5月末:完成论文并修改,准备答辩。
七、主要参考文献
[1] 朱长甫,陈星,王英典. 植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用 [J]. 植物生理与分子生物学学报,2004,30(6):609~618.
[2] 王伟杰. 柑桔果实色泽与类胡萝卜素积累的关系研究 [C]. 浙江大学硕士学位论文. 2006.
[3] Liu Q.,Xu J.,Liu Y. Z., et al. A novel bud mutation that confer abnormal patterns of lycopene accumulation in sweet orange fruit (Citrus sinensis L. Osbeck) [J]. Journal of Experimental Botany,2007,58(15-16):4161~4171.
[4] Harjes C.E.,Rocheford T.R.,Bai L.,et al. Natural genetic variation in Lycopene epsilon cyclase tapped for maize biofortification [J]. Science,2008,319(5861):330~333.
[5] Paine J.A.,Shipton C.A.,Chaggar S.,et al. Improving the nutritional value of golden rice through increased pro-vitamin A content [J]. Nature Biotechnology,2005,23(4):482~487.
[6] Ye X.,Al-Bbaili S.,Kloti Q.,et al. Engineering the provitamin A (bata-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm[J]. Science,2000,287(5451):303~305.
[7] Romer S.,Fraser P.D., Kiano J.W.,et al. Elevation of the provitamin A content of transgenic tomato plants [J]. Nature Biotechnology,2000,18(6):666~669.
[8] 徐娟,邓秀新. 柑橘类果实汁胞的红色现象及其呈色色素[J]. 果树学报,2002,19(5):307~313.
[9] 徐娟,邓秀新. 红肉脐橙果肉中主要色素的定性及色素含量的变化[J]. 园艺学报,2002,29(3):203~208.
[10] 陶能国. 甜橙(Citrus sinensis Osbeck)红肉突变体类胡萝卜素合成相关基因的克隆与特性分析[C]. 华中农业大学博士学位论文. 2006.
[11] 金蓉. 红肉脐橙和普通脐橙果实类胡萝卜素合成基因的差异表达[C]. 浙江大学硕士学位论文. 2007.
[12] Xu C.J.,Fraser P.D.,Wang W.J.,et al. Differences in the carotenoid content of ordinary citrus and lycopene-accumulating mutants [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006, 54(15):5474~5481.
[13] Xu J.,Tao N.G.,Liu Q., et al. Presence of diverse ratios of lycopene/beta-carotene in five pink or red–fleshed citrus cultivars [J]. Scientia Horticulture,2006,108(2): 181~-184.
[14] Tao N.G.,Hu Z.Y.,Liu Q.,et al. Expression of phytoene synthase gene (Psy) is enhanced during fruit ripening of Cara Cara navel orange (Citrus sinensis Osbeck) [J]. Plant Cell Reports,2007,26(6):837~843.
[15] Tao N.G.,Xu J.,Cheng Y.J.,et al. Lycopene-epsilon-cyclase pre-mRNA is alternatively spliced in Cara Cara navel orange (Citrus sinensis Osbeck) [J]. Biotechnology Letters, 2005, 27(11):779~782.
[16] Fraser P.D.,Bramley P.M. The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids [J]. Progress in Lipid Research,2004,43(3):228~265.
[17] Fraser P.D.,Truesdale M.R.,Bird C.R.,et al. Carotenoid biosynthesis during tomato fruit development:evidence for tissue-specific gene expression [J]. Plant Physiology,1994,105(1):405~413.
[18] Ronen G.,Cohen M.,Zamir D.,et al. Regulation of carotenoid biosynthesis during tomato fruit development:expression of the gene for lycopene epsilon-cyclase is down-regulated during ripening and is elevated in the mutant delta [J]. Plant Journal,1999,17(4):341~351.
[19] 黄新忠,陆修闽, 陈小明等. 红肉蜜柚与琯溪蜜柚亲缘关系初探[J]. 亚热带植物科学, 2006,35(4):28~31.
[20] 黄新忠,陆修闽,卢新坤等. 早熟优质蜜柚新品种—红肉蜜柚的选育[J]. 果树学报,2007,24(1):123~124.
[21] 陆修闽,刘庆,徐娟等. 红肉蜜柚果肉红色色素鉴定[J]. 亚热带植物科学,2006,35(1):39~41.
[22] Fanciullino A.L.,Dhuique-Mayer C.,Luro F.,et al. Carotenoid biosynthetic pathway in the citrus genus:number of copies and phylogenetic diversity of seven genes [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(18):7405~7417.
[23] 徐昌杰,陈昆松,张波等. 柑桔组织RNA提取方法研究[J]. 果树学报,2004,21(2):136~140.
八、指导教师意见
论文选题具有一定的可行性;设计实验过程设计合理;对于有可能发生的问题预先设计好了解决
。
签名:杨莉 2008 年 6 月 30 日
九、开题审查小组意见
同意开题
开题审查小组组长签名:徐丽珊 2008 年 6 月 30 日
继续阅读