酵母双杂交

基本思想 酵母双杂交由Fields在1989年提出. 他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究. GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域(Activati on domain,AD).DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS),并与之结合. 而AD则是通过与转录机构(transcriptionmachinery)中的其他成分之间的结合作用,以启动UAS下游的基因进行转录. DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应,但是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录. Fields建立了一个双杂交系统,BD与X蛋白融合,AD与Y蛋白融合,如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个结构域重新构成,启动特异基因序列的转录. 他们利用Snf1与Snf4的相互作用,将Snf1与DB融合,Snf4与AD融合,构建在穿梭质粒上. 其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶,Snf4是他的一个结合蛋白. 研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY:171 菌株,该菌株含有LacZ 基因,并已去除相应转录因子基因. 该实验的结果明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近,激活了报告基因LacZ的转录. 一般地,将BD-X的融合蛋白称作诱饵(bait),X往往是已知蛋白,AD-Y称作猎物(prey),能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因,通过对报告基因的检测,反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用. 基本原理 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开,仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA -结合结构域(如GAL4-bd, LexA-bd);另一个蛋白的基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad, VP16)。上述二类载体在构建融合基因时,测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达,其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence),而GAL4-ad没有。因此,在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有: GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有: GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞,酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中,蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ),从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。主要是由于:①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行,而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合,此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型, X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 发展 随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成,基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分,例如:DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明,酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作,也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此,它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子,例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的(modular),往往由两个或两个以上结构上可以分开,功能上相互独立的结构域(domain)构成,其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域(activation domain,DNA-AD)。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能,但不能激活转录,只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时,才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性,并可激活上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)的下游启动子,使启动子下游基因得到转录。 根据这个特性,将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上,在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母,这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4,又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE,因此,酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时,功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1,从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来,从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上,又发展出了酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。 常见问题与改进 酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多,二是转化效率偏低。所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD 融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,则也可单独激活报告基因的表达。因此,为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因,且每个报告基因的上游调控区各不相同,这可减少大量的假阳性。另外,报告基因通常整合到染色体上,可以使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用,还应对以下方面进行分析: (1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。 (2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。 (3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。十年来,酵母双杂交技术一直在消除假阳性方面不断改进,并且已取得较好的效果。 在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性,即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。造成假阴性的原因主要有两方面:一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱,应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。 转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一,特别是对低丰度cDNA库进行筛选时,必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化,相比之下共转化省时省力。更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时,共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中,通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。 目前很多机构建立了大量的cDNA文库和基因组文库,但这些文库大多无法直接用于双杂交系统的筛选。而文库的质量对于转化和筛选又非常关键。因此,大量构建适用于酵母双杂交的文库非常必要。现已出现一种采用体内重组技术来达到这个目的的方法。