实验1-3 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白质的凝胶电泳 试验一．蛋白质提取  （一）的研磨 一般材料是在液氮中进行研磨。 以下是玉米籽粒的蛋白质提取中的几个组织研磨液配方： 研磨液1: ① 40 mol / L Tris, pH 6.8 （水溶液） ② 1 m mol / L  PMSF（蛋白酶抑制剂） 研磨液2: ① 40 mol / L Tris, pH 8.3 （水溶液） ② 15% PVP （脱色剂） ③ 4% NP-40（裂解细胞） ④ 0.07%巯基已醇（解联蛋白） 56 ⑤DN/RN-ase ⑥总pH 7.5 研磨液3:  ① 10% 三氯已酸 （水溶液，除多糖） ② 15% PVP（脱色剂） ③ 5% 果胶酶（裂解组织和细胞） ④ 0.07%巯基已醇（解联蛋白） ⑤ 1 m mol / L  PMSF（蛋白酶抑制剂） （二）玉米蛋白质的提取和纯化程序 预备——主要试剂包括研磨液 1，纯化液1和纯化液2，先在-20℃预冷，4℃ ∣      预冷研磨液 2。 ↓ 剥胚——冷冻玉米籽粒，2 粒，戴一次性手套进行操作剥胚。 ↓ 研磨——胚置入1.5 mL 离心管中, ∣      ①加研磨液1，40 uL20 2 粒 ），在冰水浴中研磨和冲击100次。 ∣      ②加研磨液 2，100 uL （50 2 粒），研磨和冲击100次，4 ℃ ↓        下静置40 min。 纯化——①加纯化液1， 1.5 mL, -20 ℃过夜。40000g (20888 r/min) 离心 ∣        1 h，弃上液。 ∣      ②加纯化液2，1.5 mL, -20 ℃，静置1 h。4℃，40000g, 离心0.5 h， ∣        弃上液。 ∣      ③加纯化液 3（-20 ℃预冷的纯丙酮），1.5 mL, -20 ℃，静置1 h。 ↓      ④真空干燥后备用 。 提取——提取液(8M 尿，3 % CHAPS, 2 M 硫尿，1 % DTT ) ∣      ①准确称量，纯化后的干粉，20 mg。 ∣      ②加40 m mol/L  Tris 提取液50 uL, 充分振荡，4℃浸提1 h。 ∣      ③加提取液500 uL, 充分振荡，4 ℃ 条件下浸提过夜。 ∣      ④4 ℃，40000g (20888 r/min), 离心1 h。 ∣      ⑤吸取上清，1.5mL 离心管，分装100ug，上样或–20 ℃ 保存备用。 ↓      ⑥离心——4 ℃, 10000 g 离心30 min，弃上液。 保存备用。 试验二．  连续体系SDS-PAGE （一）试剂与溶液 1． 0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液 称取磷酸氢二钠（AR）Na2HPO4·2H2O 25.63g或Na2HPO4·12H2O 51.58g，再称取磷酸二氢钠（AR）NaH2PO4·H2O 7.73g或NaH2PO4·2H2O 8.74g，溶于重蒸水中并定容至1000ml。 2． 样品溶解液 0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油或40%蔗糖及0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测固体蛋白质样品。配制如3-1。 表3-1 连续体系样品溶解配制 SDS 巯基乙醇 甘油 溴酚蓝 0.2mol/L磷酸 盐缓冲液 加重蒸水至最 后体积为 100mg 0.1ml 1ml 2mg 0.5ml 10ml             如样品为液体，则应用浓度一倍的样品溶解液，然后等体积混合。 3． 凝胶贮液 称Acr 30g, Bis 0.8g, 加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶，4℃贮存可用1-2月。 4． 凝胶缓冲液 称SDS0.2g，加0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4℃贮存，用前，稍加温使SDS溶解。 5． 1%TEMED 取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶内4℃贮存。 6． 10%过硫酸铵（AP） 称AP1g，加重蒸水至10ml，此液应每周新配。置棕色瓶内，4℃贮存。 7． 电极缓冲液（0.1%SDS, 0.1mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液） 称SDS1g，加500ml 0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1000ml。 8． 1%琼脂（糖） 称琼脂（糖）1g，加100ml上述电极缓冲液使其溶解，4℃贮存。 9． 固定液 取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 10． 染色液 称考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后应用。 11． 脱色液 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。 12  凝胶单体及缓冲液配方如下： A.丙烯酰胺单体储液（30%）： ① 29.10g 丙烯酰胺 ② 0.9g N,N’-甲叉丙烯酰胺 ③分别用35 ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶解变为透明 ④双蒸水定溶到100 ml ⑤过滤 ⑥棕色瓶盛装，4℃保存。 B.分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl pH 8.8 ）: ① Tris , 1.5M, 36.34g , 双蒸水150 ml溶解 ② HCl调至 pH 8.8 ③ 双蒸水定溶到200 ml ④ 过滤 ⑤ 棕色瓶盛装，4℃保存。 C.电极缓冲液: ① Tris（FW 121.1）， 25 mM, 15.15g , 双蒸水1000 ml溶解 ② Glycine ( FW 70.07), 72g,( 192 mM ) 1000 ml双蒸水溶解 ③ SDS ( FW 70.07), 5g,( 0.1% w/v) 1000 ml双蒸水溶解 ④ 双蒸水定溶到5000 ml ⑤ HCl调至 pH8.3-9.8 （二）、  器  材 夹心式垂直板电泳槽[凝胶模（135×100×1.5mm）]，直流稳压电源（电压300-600V，电流50-100mA），吸量管（1,5,10ml），烧杯（25,50,100ml），细长头的滴管，1ml注射器及6号长针头，微量注射器（10μl或50μl），水泵或油泵，真空干燥器，大培养皿（φ×120-160mm）。 （三）、 操作方法 1．安装夹心式垂直板电泳槽 用细头长滴管吸取已熔化的1%琼脂（糖）溶液，封住长玻璃板下端与硅胶模间的缝隙。加琼脂（糖）溶液时，应防止气泡进入。琼脂（糖）溶液用连续体系配制。 2．配胶及凝胶板的制备 （1）.配胶 根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度，见表3-2。 表3-2  SDS-连续体系凝胶配制 试剂名称 配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml 5% 7.5% 10% 凝胶贮液30% Acr-0.8%Bis 3.33 5.00 6.66 0.2mol/L pH7.2磷酸缓冲液内含0.2%SDS 10.00 10.00 10.00 1% TEMED 2.00 2.00 2.00 重蒸馏水 4.57 2.90 1.23 混匀后，置真空干燥器中帛气10min 10%AP 0.10 0.10 0.10         电极缓冲液为0.1mol/L pH7.2磷酸缓冲液，内含0.1%SDS。 （2） 凝胶板的制备 SDS-连续体系凝胶板的制备：按表2配制20ml所需浓度的PAA，用细长头滴管将分离混合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘0.5cm处，插入样品槽模板。为防止渗漏，可在上、下电极槽中加入蒸馏水，但不能超过短板，以防凝胶被稀释，约30min，凝胶聚合，继续放置20-30min后，倒去上、下电极槽中的蒸馏水，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可进行预电泳或准备加样。 3．样品的处理与加样 （1） 样品的处理 根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，如上海东风生化试剂厂的低分子量标准蛋白质试剂盒，每一安瓶则需加入200μl样品溶液，自己配制标准及未知样品，按0.5-1mg/ml样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞小离心管中，轻轻盖上盖子（不要塞紧，以免加热时迸出），在100℃沸水浴中保温3min，取出冷却加样。如处理好的样品暂时不用，可放在-20℃冰箱保存较长时间，使用前在100℃水中加热3min，以除去亚稳态聚合。 （2）加样 一般每个凹形样品槽内，只加一种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10-15μl（即2-10μg）。如样品较稀，加样体积可达100μl。如样品槽中有汽泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。 4．电泳 分离胶聚合后是否进行预电泳则应根据需要而定，SDS连续系统预电泳采用30mA，60-120min。在电极槽中倒入0.1%SDS ，pH7.2 的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，连接电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接正极。打开电源，将电流调至20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至50mA，待染料前沿迁移至距硅橡胶框底边1-1.5cm处，停止电泳，一般需5-6h。 5．凝胶板剥离与固定 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为样品标志，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液，固定过夜。 6．染色与脱色 将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。