Lowry法测定蛋白质浓度

Lowry法测定蛋白质浓度 1.原理 本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜—蛋白质复合物,此复合物加入酚试剂后,产生蓝色化合物,该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比,根据供试品的吸光度,计算供试品的蛋白质含量。 2.试剂 (1)酚试剂 来源:a.配制:取钨酸钠(Na2WO4·2H2O )l00g和钼酸钠(Na2MoO3 )25g,置1500ml蒸馏瓶中,加入700ml水,85%磷酸50ml,盐酸100ml,上连回流管(使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞)微沸回流10h。取下回流管,加入l硫酸锂(Li2SO4·H2O ) 150g,水50ml,溴液几滴,煮沸约15min,去除过量的溴,冷却加水至1000ml,过滤,为酚试剂贮备液。酚试剂贮备液用NaOH滴定液(0.5mol/L)测定酸浓度,然后加水稀释至相当于1mol/L盐酸浓度。b.购买:市售酚试剂在使用前用0.5mol/L NaOH滴定液,以酚酞为指示剂,根据试剂酸度将其稀释,使最后酸度为1N。(2)碱性铜溶液 取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)溶液各0.5ml, 4%碳酸钠(Na2CO3)溶液与0.8%NaOH溶液各25ml,摇匀,即得(注:现用现配)。 (3)0.5mol/L NaOH滴定液的配制及标定 取NaOH适量,加水搅拌使溶液成饱和溶液,冷却后,置聚乙烯塑料瓶中,静止数日,澄清后,取澄清的NaOH饱和溶液28ml,加新煮沸后冷却的水,使成1000ml,摇匀。 取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g,精密称定,加新煮过的冷水50ml,摇匀,使其尽量溶解;加酚酞指示剂2滴,用本液滴定;在接近终点时,应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解,滴定至溶液显粉红色。每1ml NaOH滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量,算出本液的浓度。 (4)标准蛋白质溶液的制备 取人血白蛋白标准品1支,用水定量稀释至每1ml含1mg,作为贮备液。精密量取贮备液 2.5ml至25ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即为每1ml含100μg的标准蛋白质溶液。 3.测定方法 精密量取一定体积供试品(含蛋白质50μg左右)置试管内,加水至1ml,加碱性铜溶液5ml,摇匀,室温放置10min,快速加入酚试剂0.5ml,摇匀,室温放置30min,显色后,照紫外—可见光光度法,在波长650nm处测定吸光度(显色后,如发现混浊,3000r/min,离心15min,取上清液测定)。 精密量取标准蛋白质溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置于试管中,加水至1ml,加碱性铜溶液5ml,摇匀,室温放置10min,快速加入酚试剂0.5ml,摇匀,室温放置30min,显色后,照紫外—可见光光度法,在波长650nm处测定吸光度(显色后,如发现混浊,3000r/min,离心15min,取上清液测定)。准确量取1ml水作空白对照,具体操作方法同上。 以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度,取直线回归方程,将测定供试品的吸光度代人直线回归方程,即得供试品的蛋白质含量。